高效液相色谱法测定肾宁颗粒中黄芪甲苷的含量

【摘要】  目的：建立肾宁颗粒中黄芪甲苷的含量测定方法。方法:采用C18(4.6mm×250mm，5μm)柱,流动相为乙腈�水�冰醋酸(30:70:1)，检测波长为202nm。结果：黄芪甲苷在15-300μg范围内线性关系良好，相关系数r=0.9995，平均回收率为97.95%，RSD为0.40%。结论：此测定方法准确，重现性好，可作为制剂的质量控制方法。

【关键词】  肾宁颗粒/化学合成;黄芪甲苷/标准;高效液相色谱法;含量测定

     肾宁颗粒由黄芪、党参等４味中药组成，具有益气生阴，升清降浊，利尿通淋等功效，用于肾炎、蛋白尿等病证。为了更好控制其质量，本文采用高效液相色谱法对肾宁颗粒中的黄芪甲苷进行了含量测定［1］，现将结果报道如下。

    1  材料

    1.1  仪器  LC�10ATvp高效液相色谱仪(日本岛津)；Class�VER6.1工作站(日本岛津)；紫外分光光度计(UV�2401 PC,日本岛津)；BS124 S电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

    1.2  药品与试剂  肾宁颗粒由长春中医药大学制剂室提供；黄芪甲苷对照品(批号:0781�200311)购于中国药品生物制品检定所，乙腈为色谱纯，水为双蒸水,其他试剂为分析纯。

    2  方法

    2.1  对照品溶液的制备  精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇配制成每1ml含黄芪甲苷0.15mg的溶液，即得。

    2.2  供试品溶液的制备  取本品20g，研细，精密称定，加甲醇100ml，称定重量，加热回流提取2h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液50ml，水浴浓缩至约5ml，加水15ml，加到D101型大孔吸附树脂柱(内径1.4cm，长15cm)上，用水200ml洗脱，弃去水洗脱液，再用30%乙醇200ml洗脱，弃去30%乙醇洗脱液，继续用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液200ml，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。

    2.3  检测波长选择  精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液，于200-400nm波长下测定光谱图，在202nm处有最大吸收峰，检测波长选定为202nm。

    2.4  色谱条件与系统适应性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈－水－冰醋酸(30:70:1)为流动相；检测波长202nm；流速1ml/min。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000［2，3］。

    在上述色谱条件下，对肾宁颗粒样品、黄芪甲苷对照品、阴性对照样品进行测定，结果表明，黄芪甲苷与杂质峰没有重叠，分离效果较好。

    3  结果

    3.1  黄芪甲苷线性关系考察  精密称取黄芪甲苷对照品适量,加甲醇分别制成每1ml含黄芪甲苷对照品1.5、7.5、15、22.5、30μg的溶液，分别吸取10μl,注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积为纵坐标(Y)，以浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，回归方程y=4856.4x＋199431.6，r=0.9995。黄芪甲苷在15-300μg范围呈良好的线性关系。

 3.2  精密度试验  取同一批供试品，按2.2中方法制备供试品溶液，由不同操作人员，在不同时间，使用不同高效液相色谱仪，测定黄芪甲苷含量。结果3组样品含量的RSD为0.78%，表明样品含量测定方法有良好的精密度。

    3.3  稳定性试验  取同一供试品溶液，分别在0，2，4，10，16、24h进样，测定峰面积，其黄芪甲苷的RSD为0.52%，表明供试品溶液中黄芪甲苷在24h内稳定。

    3.4  重复性试验  取同一批样品，称取6份，按照2.2中方法制备供试品溶液，按2.4中色谱条件测定，其RSD为0.34%，表明样品中黄芪甲苷的含量测定重复性良好。

    3.5  回收率试验  取已知含量供试品(0.075mg/g)约10g,6份，分别加入6只具塞锥形瓶中，再精密量取黄芪甲苷对照品溶液(浓度为0.1528mg/ml)5ml,分别加入上述6只锥形瓶中，按2.2中方法制备供试品溶液，按2.4中色谱条件测定，计算回收率，结果见表1。

    3.6  样品的含量测定  按2.2中方法制备供试品溶液，按2.4中色谱条件对3批样品进行含量测定，结果见表2。表1  黄芪甲苷回收率(n=2)编号样品称

　　4  讨论

    4.1  在黄芪甲苷提取分离条件试验中，曾采用有机溶剂萃取，易乳化，黄芪甲苷损失较大，后改用D101大孔树脂去处杂质，含量较高，操作简便，重现性也较好。

    4.2  由液相图谱表明：按处方比例制备缺黄芪的阴性对照样品，在黄芪甲苷保留时间的相应位置上无黄芪甲苷峰出现，阴性对照无干扰，此方法专属性强，且分离效果好，方法准确可靠，可用于肾宁颗粒的质量控制。

【参考文献】
［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典1部［M］.北京:化学工业出版社,2005.212.

［2］韩建伟,高华宏,乔 明.HPLC�ELSD法测定通脉活血丸中黄芪甲苷的含量研究［J］.湖北中医学院学报,2007,9(1):55-56.

［3］杨克迪,李 宏,等.固相萃取�高效液相色谱法测定黄芪中黄芪甲苷的含量［J］.时珍国医国药,2007,18(1):41-42.