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1.样品制备:将待测激素样品进行处理,如加标准品、调节pH值、蛋白质去除和提取等,使其达到HPLC测定的要求。
2.样品进样:将样品通过进样器注入HPLC系统中。
柱子选择:根据待测激素的特性,选择适合的色谱柱。
3.流动相制备:根据样品的特性,选择合适的流动相,如水、甲醇、醋酸等,并按照一定的比例混合。
4.色谱条件设置:根据样品性质、柱子类型和流动相,设置一定的流速、温度、波长等参数以保证良好的分离效果。
5.HPLC分离:样品进入色谱柱后,根据分子在柱中的亲和性差异,经过分离和纯化。
6.检测:通过检测器检测样品的吸收峰和荧光峰等,以便于定量和鉴定激素。
7.数据处理:根据检测出的峰面积或峰高等信息,利用内标法或外标法计算出激素的浓度。
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基本步骤如下:
样品制备:将生物样品(例如血清、尿液、组织)离心去除悬浮物,取上清液进行处理。处理方式包括加入提取剂提取、加入有机溶剂沉淀蛋白等。
衍生化反应:对一些不具有天然荧光或吸收的激素,需要进行衍生化反应,以便在色谱中检测到。衍生化反应方式包括加入荧光素衍生化剂、取代基衍生化剂等。
样品进样:将处理后的样品注入进样器中,通过自动进样阀进入HPLC色谱系统。
色谱分离:将样品在高压作用下通过高效液相色谱柱进行分离,柱子内填充不同材质的固定相,以分离激素。
检测:使用紫外检测器或荧光检测器检测分离后的化合物,得到吸收或荧光信号,再通过计算机或积分器将信号转化为峰面积或峰高。
数据处理:通过标准曲线或外标法等方法,将测得的峰面积或峰高值转换为激素的浓度。