原理
高效液相色谱仪液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。
液相色谱根据固定向的性质可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和大小排阻色谱。其中反相键合相色谱应用最广，键合相色谱法是将类似于气相色谱中固定液的液体通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相，极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。
反相键合相色谱采用醇-水或腈-水体系作为流动相，纯水廉价易得，紫外吸收小，在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37―）键合到硅胶表面，这也就是我们通常所说的碳十八柱。
液相色谱根据固定向的性质可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和大小排阻色谱。其中反相键合相色谱应用最广，键合相色谱法是将类似于气相色谱中固定液的液体通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相，极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。
反相键合相色谱采用醇-水或腈-水体系作为流动相，纯水廉价易得，紫外吸收小，在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37―）键合到硅胶表面，这也就是我们通常所说的碳十八柱。
材料与仪器
高效液相色谱仪
步骤
1、仪器使用前的准备工作
（1）样品与流动相的处理
配好的溶液需要用 0.45 μm 的一次性过滤膜过滤。纯有机相或含一定比便例有机相的就要用有机系的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。
水、甲醇等过滤后即可使用；水放置一天以上需重新过滤或换新鲜的水。含稳定剂的流动相需经过特殊处理，或使用色谱纯的流动相。
（2）更换泵头里清洗瓶中的清洗液
流动相不同，清洗液也不同，如果流动相为甲醇-水体系，可以用 50%的甲醇；如果流动相含有电解质，通常用 95%去离子水甚至高纯水。
如果仪器经常使用建议每周更换两次，如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。
（3）更换托盘里洗针瓶中的洗液
洗液一般为：50%的甲醇。
2、排除泵内气泡
开关排气阀时泵一定要关掉。具体操作如下：
（1）在泵关闭的情况下，打开排气阀。
（2）选择要排气泡的通道，打开泵。
（3）按下泵前面板右下方的“Purge”键，仪器将以 6.0 mL/min 的速度自动快速清洗泵内残留的气泡，5 分钟将自动停止。若想想手动停止，则再按再按“Purge”键，将停止清洗。
（4）换其他通道，排气泡。
注意：使用快速清洗阀时，只能一个一个通道的排气泡，不得将几个通道同时按比例排气泡，比例阀的快速切换易导致损坏。
（5）流路中没有气泡后，将泵关掉，再关排气阀。
注意：排气阀不能拧的过紧，也不能拧的过松，拧得过松流动相容易从清洗阀部位流进泵头中引起报警。
3、设置柱温箱的温度
按住柱温箱上的“+”或“-”键，直到数字开始闪烁时设定温度。
4、系统的准备
（1）分析样品前先用甲醇或乙腈冲洗流路约 20 分钟，平衡活化色谱柱，并赶走管路中的杂质和水分。
（2）若流动相为有机相与水相的混合物，则第 1 步完成后，按照分析样品的需要调节例阀的比例后冲洗流路约 20 分钟后，待基线走平后即可进样。
（3）若流相中含有缓冲盐溶液、有机/无机酸或其它电解质，则第 1 步完成后用 95%的去离子水冲洗流路约 20 分钟后，再按照分析样品的需要调节比例阀的比例后冲洗流路约 20 分钟后，待基线走平后即可进样。
5、洗针
做样之前，按自动进样器面板上的“wash”键，洗针并排掉针中残留的气泡。若针中气泡仍未清除，则再次按“wash”键直至的的气泡清除为止。
6、进样
（1）程序文件的建立
泵的流速、各通道的比例；自动进样器的进样体积；柱温箱的温度；检测器的波长、测每个样品需要的时间等等，都得在程序文件里指定。
（2）方法文件的建立
进样后，软件会自动采集到色谱图，需要一个方法文件对这些谱图进行处理。如积分、定性、定量等等。
（3）样品序列的建立
标样有多少个、样品有多少个，分别要进多少体积等等，都得在序列文件里指定。
（4）进样
（5）数据处理与报告打印
（1）样品与流动相的处理
配好的溶液需要用 0.45 μm 的一次性过滤膜过滤。纯有机相或含一定比便例有机相的就要用有机系的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。
水、甲醇等过滤后即可使用；水放置一天以上需重新过滤或换新鲜的水。含稳定剂的流动相需经过特殊处理，或使用色谱纯的流动相。
（2）更换泵头里清洗瓶中的清洗液
流动相不同，清洗液也不同，如果流动相为甲醇-水体系，可以用 50%的甲醇；如果流动相含有电解质，通常用 95%去离子水甚至高纯水。
如果仪器经常使用建议每周更换两次，如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。
（3）更换托盘里洗针瓶中的洗液
洗液一般为：50%的甲醇。
2、排除泵内气泡
开关排气阀时泵一定要关掉。具体操作如下：
（1）在泵关闭的情况下，打开排气阀。
（2）选择要排气泡的通道，打开泵。
（3）按下泵前面板右下方的“Purge”键，仪器将以 6.0 mL/min 的速度自动快速清洗泵内残留的气泡，5 分钟将自动停止。若想想手动停止，则再按再按“Purge”键，将停止清洗。
（4）换其他通道，排气泡。
注意：使用快速清洗阀时，只能一个一个通道的排气泡，不得将几个通道同时按比例排气泡，比例阀的快速切换易导致损坏。
（5）流路中没有气泡后，将泵关掉，再关排气阀。
注意：排气阀不能拧的过紧，也不能拧的过松，拧得过松流动相容易从清洗阀部位流进泵头中引起报警。
3、设置柱温箱的温度
按住柱温箱上的“+”或“-”键，直到数字开始闪烁时设定温度。
4、系统的准备
（1）分析样品前先用甲醇或乙腈冲洗流路约 20 分钟，平衡活化色谱柱，并赶走管路中的杂质和水分。
（2）若流动相为有机相与水相的混合物，则第 1 步完成后，按照分析样品的需要调节例阀的比例后冲洗流路约 20 分钟后，待基线走平后即可进样。
（3）若流相中含有缓冲盐溶液、有机/无机酸或其它电解质，则第 1 步完成后用 95%的去离子水冲洗流路约 20 分钟后，再按照分析样品的需要调节比例阀的比例后冲洗流路约 20 分钟后，待基线走平后即可进样。
5、洗针
做样之前，按自动进样器面板上的“wash”键，洗针并排掉针中残留的气泡。若针中气泡仍未清除，则再次按“wash”键直至的的气泡清除为止。
6、进样
（1）程序文件的建立
泵的流速、各通道的比例；自动进样器的进样体积；柱温箱的温度；检测器的波长、测每个样品需要的时间等等，都得在程序文件里指定。
（2）方法文件的建立
进样后，软件会自动采集到色谱图，需要一个方法文件对这些谱图进行处理。如积分、定性、定量等等。
（3）样品序列的建立
标样有多少个、样品有多少个，分别要进多少体积等等，都得在序列文件里指定。
（4）进样
（5）数据处理与报告打印
注意事项
1、泵
（1） 放置了一天或以上的水相或含水相的流动相如需再用，需用微孔滤膜重新过滤。
（2）流动相禁止使用氯仿、三氯（代）苯、亚甲基氯、四氢呋喃、甲苯等；慎重使用四氯化碳、乙醚、异丙醚、酮、甲基环己胺等，以免造成对柱塞密封圈的腐蚀。
2、柱温箱
柱温箱一旦发生报警，一定要及时找到原因。若实验室湿度太高，则需采取相应的除湿措实。若柱温箱中发生漏液现象，则需及时拧紧色谱柱并擦干漏液，长时间的漏液极易损坏柱温箱中的传感器。
3、检测器
（1） 检测器的紫外或可见灯在长期打开的情况下，一定要保证有溶液流经检测池。若不需要做样，可设置一个较低的流速（如 0.05mL/min）或关闭灯的电源。
（2）检测器的灯一般是在流通池有溶液连续流动几分钟后才开的。如果流动池中有气泡，则会提示漂移过大无法通过自检和校正。
（3）检测器的氘灯或钨灯不要经常开关，每开关一次灯的寿命约损失 30 小时。若仪器经常使用，可几天开关灯一次。
4、整个系统
（1） 缓冲溶液的浓度不能高于 0.5 mol/L，pH 范围 2～12，Cl-的浓度要小于 0.1 mol/L（防
止腐蚀流路）。
（2）仪器长时间不用，每个泵通道和整个流路一定要用甲醇冲洗后保存，以免结晶或造成污染。（3）待测样品或标样在流动相中一定要易溶，否则进样后会结晶造成定量不准确或堵塞色谱柱。
5、软件
采集紫外信号时，若分析物质的最大波长已知，则尽量减少采集的通道个数，以免占用电脑的空间，特别是 PDA-100 检测器。
（1） 放置了一天或以上的水相或含水相的流动相如需再用，需用微孔滤膜重新过滤。
（2）流动相禁止使用氯仿、三氯（代）苯、亚甲基氯、四氢呋喃、甲苯等；慎重使用四氯化碳、乙醚、异丙醚、酮、甲基环己胺等，以免造成对柱塞密封圈的腐蚀。
2、柱温箱
柱温箱一旦发生报警，一定要及时找到原因。若实验室湿度太高，则需采取相应的除湿措实。若柱温箱中发生漏液现象，则需及时拧紧色谱柱并擦干漏液，长时间的漏液极易损坏柱温箱中的传感器。
3、检测器
（1） 检测器的紫外或可见灯在长期打开的情况下，一定要保证有溶液流经检测池。若不需要做样，可设置一个较低的流速（如 0.05mL/min）或关闭灯的电源。
（2）检测器的灯一般是在流通池有溶液连续流动几分钟后才开的。如果流动池中有气泡，则会提示漂移过大无法通过自检和校正。
（3）检测器的氘灯或钨灯不要经常开关，每开关一次灯的寿命约损失 30 小时。若仪器经常使用，可几天开关灯一次。
4、整个系统
（1） 缓冲溶液的浓度不能高于 0.5 mol/L，pH 范围 2～12，Cl-的浓度要小于 0.1 mol/L（防
止腐蚀流路）。
（2）仪器长时间不用，每个泵通道和整个流路一定要用甲醇冲洗后保存，以免结晶或造成污染。（3）待测样品或标样在流动相中一定要易溶，否则进样后会结晶造成定量不准确或堵塞色谱柱。
5、软件
采集紫外信号时，若分析物质的最大波长已知，则尽量减少采集的通道个数，以免占用电脑的空间，特别是 PDA-100 检测器。
来源：丁香实验
