祖卡木颗粒中罂粟碱含量的反相高效液相色谱法测定

　　【摘要】 　　目的采用反相高效液相色谱（RP�HPLC）法测定祖卡木颗粒中罂粟碱的含量。方法使用DIKMA C8色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），甲醇�乙腈�1%三乙胺�1%乙酸铵（40∶20∶1∶39）为流动相，流速1 ml/min，检测波长为240 nm。结果罂粟碱在0.019 8～0.396μg范围内呈良好线性关系（r＝0.999 9），平均回收率为99.6%，RSD为1.5%。结论该法灵敏、准确，专属性强，重复性好，可以作为祖卡木颗粒的含量测定方法。

　　【关键词】  祖卡木颗粒 高效液相色谱法 罂粟碱

　　Abstract:Objective To establish a method for determining papaverine in Zukamu Granules.MethodsThe separation was carried out on DIKMA C8 column（250 mm×4.6 mm，5 μm）.The mobile phase was carbinol-acetonitrile-1% triethylamine -1% ammonium acetate（40∶20∶1∶39）with a flow rate of 1.0ml/min.The detection wavelength was set at 240 nm.ResultsPapaverine showed a good linear relationship in the range of 0.0198～0.396μg（r＝0.999 9）and the average recovery was 99.6% ,RSD was1.5%.ConclusionThe method is sensitive,accurate, specific and repeatable. It can be used for quality control of Zukamu Granules.

　　Key words：Zukamu Granules;   HPLC;  Papaverine

　　由山柰、睡莲花及罂粟壳等药味的提取物组成的祖卡木颗粒，具有清热、发汗、通窍的功效，用于感冒咳嗽、发热无汗、咽喉肿痛、鼻塞流涕等症。方中罂粟壳含有罂粟碱，久服易成瘾，过量摄入会引起心率不齐，严重时致人死亡。文章研究采用反相高效液相色谱法测定罂粟碱的含量，为控制祖卡木颗粒的质量提供依据。

　　1  仪器与试药

　　1.1  仪器

　　岛津LC－10AT高效液相色谱仪（日本岛津公司），HW-2000色谱工作站，C8柱（250mm×4.6mm，5μm）（迪马公司），超声清洗提取器。

　　1.2 试药

　　甲醇为色谱纯（天津四友生物医学技术开发公司），水为超纯水，余试剂为分析醇，盐酸罂粟碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：171214－200403）。

　　2  方法

　　2.1   色谱条件

　　C8色谱柱，甲醇-乙腈-1%三乙胺-1%乙酸铵（40∶20∶1∶39）为流动相，流速1 ml/min，检测波长为240 nm。

　　2.2   供试品溶液的制备

　　取本品约2.5 g，精密称定，置100 ml具塞锥形瓶中，加入氨试液10 ml润湿碱化后，加三氯甲烷50 ml，振摇5 min，超声80 min后移至分液漏斗中，静止分层，分取三氯甲烷层，水层用30 ml三氯甲烷分3次萃取，合并三氯甲烷溶液，水浴挥干三氯甲烷，残渣用甲醇溶解并移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，进柱前用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

　　2.3  对照品溶液的制备

　　取盐酸罂粟碱适量，105℃下干燥2 h，精密称定，加甲醇制成每毫升含39.6 μg的溶液，作为对照品溶液。

　　2.4  阴性对照溶液的制备

　　去除祖卡木颗粒处方中的罂粟壳，按祖卡木颗粒生产工艺制备阴性制剂，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

　　3  结果

　　3.1  干扰实验

　　照上述色谱条件，分别取供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液各20 μl，注入色谱仪，记录色谱图，图中显示，盐酸罂粟碱的峰形良好，且与样品杂质峰完成分离，阴性对照溶液无干扰。结果见图1～3。

　　3.2   线性范围实验

　　分别精密吸取一定量的对照品溶液稀释成浓度为0.99，1.98，2.97，4.95，9.90，14.85，19.80μg/ml的标准溶液。按上述色谱条件分别进样20μl，取3次峰面积的平均值，对盐酸罂粟碱的进样量（μg）进行线性回归，得回归方程Y = 4563.5X + 18009（r=0.999 9，n=7）结果表明盐酸罂粟碱在0.019 8 ～0.396μg范围内线性关系良好。

　　3.3  精密度实验

　　取盐酸罂粟碱对照液，按上述色谱条件连续进样6次，20μl/次，测定峰面积，其RSD为1.44%，结果表明精密度良好。

　　3.4   重复性实验

　　取同一批号样品，按“2.2”方法平行制备6份供试品溶液，分别进行含量测定，RSD为1.7%。

　　3.5  稳定性实验

　　取供试品溶液，按上述色谱条件，每隔2 h进样1次，记录峰面积，结果表明供试品溶液在8 h内基本稳定，RSD为1.0%。结果见表1。表1  稳定性实验（略）

　　3.6  加样回收率实验

　　精密称取已知含量的样品（批号060728）6份，分别精密加入盐酸罂粟碱对照液（39.6μg/ml）1ml，按“2.2”方法平行制备供试品溶液，分别进行含量测定，结果平均回收率为99.6%，RSD为1.5%。结果见表2。

　　3.7   样品的测定

　　取5批样品，分别按“2.2”方法平行制备供试品溶液，分别进行含量测定。结果见表3。表2  加样回收率实验结果（略）

　　4  讨论

　　4.1  流动相的选择

　　曾考察甲醇-乙腈-1%三乙胺-1%乙酸铵（55∶5∶1∶39）；甲醇-乙腈-1%三乙胺-1%乙酸铵（50∶10∶1∶39）；甲醇-乙腈-1%三乙胺-1%乙酸铵（45∶15∶1∶39）；甲醇-乙腈-1%三乙胺-1%乙酸铵（40∶20∶1∶39）；甲醇-乙腈-1%三乙胺-1%乙酸铵（30∶30∶1∶39），结果以甲醇-乙腈-1%三乙胺-1%乙酸铵（40∶20∶1∶39）为流动相分离效果最好。表3  祖卡木颗粒样品含量测定结果（略）

　　4.2  检测波长的选择

　　取罂粟碱对照品溶液，在紫外分光光度计上进行扫描测定，于243.5 nm处有强吸收，在280.0及311.5 nm处有弱吸收，同时参阅有关文献［1～4］，故此选择240 nm为检测波长。

　　4.3  供试品溶液制备方法的选择

　　本品中罂粟碱含量相对较少，故采用液液萃取的方法进行提取富集。基本方法是利用罂粟碱呈碱性，经氨试液或氨水碱化后游离，再用有机溶剂三氯甲烷提取。曾比较了两者碱化试剂，发现用氨水碱化容易产生乳化现象，不易分层，故采用氨试液为碱化试剂。提取方法上曾比较了冷浸法（室温24 h）和超声提取法，结果表明超声提取法提取效率高，结果稳定。在超声时间方面，比较了20，40，60，80，100 min的提取率，结果表明时间延长到60 min，提取率基本不再提高，为保证提取完全，保守的方法把超声时间确定为80 min。

　　【参考文献】
　　［1］文 杰，马 开，高 寒，等．HPLC测定强力枇杷露中罂粟碱的含量［J］.中国中药杂志，2006，31（16）：1330.

　　［2］陈庆伟．HPLC法测定盐酸罂粟碱氯化钠注射液中盐酸罂粟碱的含量［J］.海峡药学，2005，17（6）：74.

　　［3］陆茂林，赵春城，蔡建荣，等．罂粟碱检测方法进展［J］.中国卫生检验杂志，2002，12（4）：504.

　　［4］肖艳萍，林 海，黄 云．HPLC测定注射用盐酸罂粟碱的含量［J］.中国药师，2006，9（7）：628