反相高效液相色谱法测定当归调经冲剂中阿魏酸的含量

【摘要】  目的：建立以反相高效液相色谱法测定当归调经冲剂中阿魏酸含量的方法。方法：色谱柱为Agillent ODS C18柱（4.6mm×250 mm，5μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸（37:63），检测波长为316nm，柱温为25℃，流速为1.0ml/min。结果：阿魏酸进样量在0.0232～0.2552μg内线性关系良好（r=0.9999），平均加样回收率为99.40%（RSD=1.60%,n=5）。结论：本法简便、准确、专属性强，重现性好，可用于该制剂的质量控制。

【关键词】  当归调经冲剂 阿魏酸 反相高效液相色谱
       Determination of Ferulic acid in Dangguitiaojing Granules by RP-HPLC

      【Abstract】Objective:To establish a RP-HPLC method for determination of ferulic acid in Dangguitiaojing granules.Methods:HPLC Agillent ODS C18(4.6mm×250mm,5μm) was used and Methol-0.1%H3PO4(37:63) as moblie phase.The detective wavelength was set at 316nm,the column temperature was at 25℃,and the flow rate was 1.0ml/min.Results:Ferulic acid showed a good linearity in the range of 0.0232～0.2552μg(r=0.9999).The average recovery was 99.40%,RSD was 1.60%(n=5).Conclusion:This simple,accurate and specific method can be used for quality control of Dangguitiaojing granules.

      【Key words】Dangguitiaojing Granules;ferulic acid;RP-HPLC

      当归调经冲剂由当归、熟地黄、川芎、党参等七味中药组成，补血助气，调经。用于贫血衰弱，病后、产后血虚以及月经不调、痛经，为妇科临床常用中成药。卫生部药品标准中药成方制剂第十册（WS3-B-1925-95）中仅有针对挥发油的理化鉴别项目，无定性及含量测定项目[1]，且目前也尚无此方面的文献报道，为提高原制剂的质量标准，笔者采用反相高效液相色谱法对当归调经冲剂中的阿魏酸进行了含量测定，建立了可靠、准确、专属性强的质量控制方法。

    1  仪器和试药

    1.1  仪器  HP1100高效液相色谱仪，HP ChemStation色谱工作站；赛多利斯万分之一电子天平（德国）；超声波清洗机（江苏昆山超声仪器有限公司）。

    1.2  试药  阿魏酸对照品（供含量测定用，由中国药品生物制品检定所提供，批号：0773-9910），当归调经冲剂及阴性对照样品（本院制剂室提供，批号070105、070111、070119）。甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其余化学试剂均为分析纯。

    2  方法与结果[2～4]

    2.1  色谱条件与系统适应性试验  色谱柱：Agillent C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（37:63）；检测波长：316nm；柱温：25℃；流速：1.0ml/min，理论塔板数按阿魏酸峰计算应不低于3000。结果阿魏酸峰与其它化合物峰分离良好，色谱图见图1。

    2.2  对照品溶液的制备  精密称取干燥至恒重的阿魏酸对照品适量，加70%甲醇溶解制成浓度为23.2μg/ml的溶液，即得。

    2.3  供试品溶液的制备  取装量差异项下的本品，研细，取约1.0g，精密称定，置锥形瓶中，精密加70%甲醇溶液20ml，密塞，摇匀，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

    2.4  阴性样品溶液的制备  按处方工艺制备不含当归和川芎的阴性样品，按2.3项相同方法制成阴性样品溶液，即得。

    2.5  空白干扰试验  按2.1项下的色谱条件，精密吸取上述对照品、供试品、阴性样品溶液各10μl进样测定，结果阴性样品在与供试品和阿魏酸对照品相同保留时间处，无干扰峰出现，故可以确定处方中其他药材成分对阿魏酸的含量测定不产生干扰，色谱图详见图1。

    2.6  线性关系及标准曲线  精密吸取对照品溶液1、3、5、7、9、11μl，按2.1项下色谱条件测定峰面积，以峰面积（A）对进样量（X）μg进行线性回归，Y=6146.14x－5.72，r=0.9999；阿魏酸在0.0232～0.2552μg内线性关系良好。

2.7  精密度试验  精密吸取对照品溶液10μl重复进样6次，按2.1项下色谱条件测定峰面积，结果RSD=0.56%，表明本法精密度良好。

    2.8  稳定性试验  精密吸取供试品溶液10μl，分别于0、2、4、8、12小时按2.1项下色谱条件测定5次，结果RSD=1.64%，表明供试品溶液于12小时内基本稳定。

    2.9  重现性试验  取同一批样品（批号：070105）5份，按2.3项下方法制备供试品溶液，进样10μl，并按2.1项下色谱条件测定，结果平均含量为0.3462mg/g，RSD=1.12%，表明本法重现性良好。

    2.10  加样加收试验  取已知含量的当归调经冲剂粉末约0.5g （批号：070105），精密称定，分别精密加入一定量的阿魏酸对照品，进样10μl，按2.3项下方法处理，并按2.1项下色谱条件测定，结果详见表1。表1   加样回收率试验（略）

    2.11  样品中阿魏酸含量测定  取3批样品，按2.3项下方法制备供试品溶液，并按2.1项下的色谱方法对三批样品的阿魏酸含量进行测定，结果见表2表2  样品中阿魏酸的含量测定结果（略）

    3  讨论

      方中当归为君药，川芎为臣药，而阿魏酸为当归和川芎的主要有效成分，现代药理研究表明，阿魏酸具有稳定红细胞膜，抑制补体3b（Cab）与红细胞膜的结合，降低补体及OH－等引起的溶血作用；参与巨噬细胞、淋巴细胞的激活，从而分泌较高活性的红系造血调控因子，促进红系造血。与当归调经冲剂的功效相一致，故将阿魏酸作为该制剂的质量控制指标科学、合理。

      阿魏酸可溶于甲醇、乙醇等，故对不同提取溶媒（甲醇、无水乙醇、70%甲醇）进行了考察，结果采用70%甲醇提取效率最高，同时对阿魏酸提取方法（索氏提取、超声提取及回流提取）及提取时间等影响因素进行了考察，发现对该制剂来说，药典所采用的回流法[4]提取效果不如超声法，且仅需20分钟即可超声提取完全，极大地简化了操作步骤。

      本品药味较多，成分复杂，主要有效成分阿魏酸呈酸性，在中性流动相中易发生离解，使含量偏低且拖尾严重，故须采用离子抑制技术。通过在流动相中加入一定量的酸来抑制拖尾，曾尝试对不同配比的甲醇-磷酸溶液以及甲醇-乙酸溶液洗脱系统进行了考察，经发复优化，结果阿魏酸在本色谱条件下分离效果较好，且空白无干扰，重现性良好。

【参考文献】
[1] 国家药典委员会，编．卫生部药品标准中药成方制剂第十册[M]．北京：化学工业出版社，2001：55．

[2] 赵建平，张玲，张美玲．HPLC测定风湿宁胶囊中阿魏酸的含量[J]．中成药，2004，26（12）：1080．

[3] 谢秉湘，陈静．高效液相色谱法测定妇科十味片中阿魏酸的含量[J]．中国实验方剂学杂志，2006，12（9）：23～24．

[4] 王卫锋，康阿龙，汤迎爽，等．HPLC测定妇月康胶囊中阿魏酸的含量[J]．中成药，2004，26（6）：8～9．

[5] 国家药典委员会，编．中华人民共和国药典2005版（一部）[S]．北京：化学工业出版社，2005：89．