高效液相色谱法测定三棱超临界萃取物中芦丁的含量

　　【摘要】目的 建立三棱超临界CO2萃取物中芦丁的鉴别和含量测定方法。方法在聚酰胺膜上点样，以80%乙醇作为展开剂鉴别芦丁，采用Symmetry C18色谱柱，以乙腈-四氢呋喃-0.2%枸橼酸（14∶1∶85）为流动相，柱温25℃，在流速为1.0 ml・min-1，360 nm的检测波长下，测定芦丁含量。结果在三棱的超临界萃取物中含有芦丁成分，建立的液相色谱方法在芦丁浓度为0.003 40～0.02432 mg・ml-1的范围内线性关系良好，样品在8 h内稳定，平均加样回收率为98.56%，以峰面积作精密度实验，RSD为1.38%。结论三棱的超临界萃取物中含有芦丁，建立的高效液相色谱方法线性关系良好，精密度和回收率高，适合于三棱中芦丁含量的测定。

　　【关键词】  反相高效液相色谱； 薄层色谱鉴别； 芦丁； 超临界萃取

　　Determination of Rutin in SFE Extract of Sparganium stoloniferum by RP�HPLC

　　LI Ke�yi，   LIU Hong�meundefined

　　(Biochemical Engineering College of Beijing Union University,Beijing 100023,China)

　　Abstract:ObjectiveTo explore whether there is rutin in SFE extract of Sparganium stoloniferum by TLC and establish a method to determine its content by RP-HPLC. Methods The determination was carried out over a Symmetry C18 column at 25℃. Methods tetrahydrofuran: 0.2% citric acid (14∶1∶85) was used as mobile phase at a velocity of 1 ml・min-1 and the detection wavelength was set at 360nm. ResultsRutin was found in SFE extract of Sparganium Stoloniferum. The calibration curve was linear in the range of 0.003 40～0.02432 mg・ml-1 for rutin. The sample was stable within 8 hours and the recovery rate of rutin was 98.56 %. And in precision test, RSD=1.38%. ConclusionThere is rutin in SFE extract of Sparganium stoloniferum. The established RP-HPLC method has perfect linear relationship, high precision and recovery rate and it is suitable to determine the content of rutin in SFE extract of Sparganium Stoloniferum.

　　Key words: RP-HPLC; TLC; Rutin;  Supercritical extract

　　三棱Sparganium stoloniferum，始载于《本草拾遗》，为常用中药，是荆三棱科植物黑三棱的干燥块茎，主要含挥发油类和黄酮类［1～3］，具有抗凝血及抗血栓和镇痛作用［4］，临床用于治疗中风病、冠心病、宫外孕、阑尾周围脓肿及慢性肝炎、慢性盆腔炎等。另外其和莪术一起使用具有抑制肿瘤的功能［5］，在抗癌中药的配方中起着非常重要的作用。目前文献关于三棱的提取研究并不多，尤其是对其化学成分等基础研究更少，文献［6］报道的黄酮类成分为山萘酚和5,7,3',5'-四羟基双氢黄酮醇-3-O-β-D-葡萄糖苷，还没有三棱中含有芦丁成分的文献报道。因此本实验采用薄层色谱法对三棱超临界二氧化碳萃取物中芦丁进行了鉴定，并利用高效液相色谱法对芦丁的含量进行测定。

　　1  仪器与材料

　　1.1  仪器与试剂

　　江苏南通华安公司的Ha120-50-01型超临界萃取装置；岛津LC-10AT vp高效液相色谱仪，岛津Shimadzu CLASS-VP V6.12 SP4工作站；KQ - 250B 型超声波清洗器。

　　1.2  对照品与供试品

　　三棱（北京同仁堂集团）；芦丁对照品（中国生物制品检定所）；甲醇（分析纯）；乙腈（色谱纯）；四氢呋喃（色谱纯）；枸橼酸（色谱纯）；二氧化碳（99.95%）；本实验用水均为超纯水。

　　2  方法与结果

　　2.1  三棱超临界提取物中芦丁的薄层鉴别

　　2.1.1  供试品溶液的制备

　　三棱生药粉碎、过40目筛、60℃烘干6 h ，精确称1 000 g过筛的三棱粉，加入180 ml夹带剂，充分混合过夜，然后置于萃取釜中。对萃取釜、解析釜Ⅰ、解析釜Ⅱ分别进行加热,当温度分别达到设定温度时,通过高压泵对萃取釜和两个解析釜进行加压,当压力分别达到设定压力后,进行静态萃取，之后开始循环萃取,并保持恒温和恒压,CO2流量为40 L/h。萃取2h后,从解析釜I和Ⅱ的出料口放出黄色油状液体,萃取物称重，量体积，过滤，滤液转移至100 ml量瓶中，用甲醇定容，摇匀得供试品溶液。

　　2.1.2  芦丁对照品溶液I的制备

　　精密称取芦丁对照品1.0 mg，置于50 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成0.02 mg・ml-1的供试品溶液。

　　2.1.3  薄层鉴别

　　用定量毛细管分别吸取上述对照品溶液I、供试品溶液各20 μl，于聚酰胺膜上分别点样，以80%乙醇作为展开剂，展开，晾干，以1%的三氯化铝乙醇溶液显色，置紫外灯下检视，供试品溶液在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，说明样品中含有芦丁成分。

　　2.2  三棱超临界萃取物中芦丁含量的测定

　　采用高效液相色谱法测定样品中芦丁的含量。

　　2.2.1  色谱条件色谱柱：Symmetry C18（250 m×4.6 nm，5 μm）；流动相：乙腈-四氢呋喃-0.2%枸橼酸（14∶1∶85），柱温25℃；检测波长：360 nm，流速为1.0 ml・min-1，20 μl进样（定量环）。在此条件下，30 min左右出峰，样品中芦丁和其他物质分离良好。

　　2.2.2  色谱系统适用性实验按芦丁峰计算，色谱系统的理论塔板数为57 059；芦丁与其前后相邻的色谱峰的分离度分别为2.3和1.5，芦丁与相邻的色谱峰可以完全分离。芦丁峰的拖尾因子为1.07，峰形对称性良好。

　　2.2.3 对照品溶液II的制备精密称取芦丁对照品15.0 mg，置于50 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.3 mg・ml-1的对照品溶液Ⅱ。

　　2.2.4 线性关系精密吸取对照品溶液Ⅱ 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 ml置于10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。按“2.2.1”色谱条件测定。以峰面积为横坐标、进样浓度为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程：

　　Y=-5.738 0×10-5+6.270 8×10-8X,r=0.999 9

　　结果：芦丁在0.003 04 ～0.024 32 mg・ml-1浓度范围内线性关系良好。

　　2.2.5 样品稳定性实验样品溶液室温放置，每隔2 h进样一次，测定芦丁的含量，共测5次，RSD为1.87%，说明样品溶液在8 h内基本稳定。

　　2.2.6  精密度实验取同一浓度的样品溶液，连续进样6次，测定芦丁的含量，RSD为1.38%。

　　2.2.7 加样回收率实验精密吸取5 ml已知含量的供试品溶液6份，分别置于10 ml量瓶中，分别准确加入5 ml浓度为0.30 mg・ml-1的芦丁对照品溶液，摇匀，过滤，取续滤液分别进样，按选定的色谱条件操作，测定其浓度，并计算回收率。结果见表1。表1  加样回收率实验结果

　　（略）

　　2.2.8  样品的测定按上述“2.1.2”方法制备供试品溶液，并根据“2.2.1”色谱条件进行测定，用标准线性方程计算出各供试品溶液中芦丁的含量，进而计算出基于每克生药材的芦丁含量。

　　2.3  三棱的超临界萃取样品测定根据表2的实验条件安排实验，实验方法见“2.1.1”，每个实验条件均重复3次,取平均结果，萃取物中芦丁的含量如表2所示。表2  实验结果（略）

　　3 讨论

　　薄层色谱表明在三棱超临界萃取物中含有芦丁成分。

　　利用紫外分光光度法在200～500 nm的波长范围内扫描对照品溶液，在360 nm处对照品有最大吸收，确定360 nm为检测波长。

　　在HPLC流动相的选择中，分别选择了甲醇和乙腈为流动相的有机相，并分别考察了乙醇-水-磷酸和乙腈-四氢呋喃-0.2%枸橼酸两个系统在不同配比、不同流速条件下对样品测定的影响，最后确定流动相为乙腈-四氢呋喃-0.2%枸橼酸（14∶1∶85）。

　　采用Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈-四氢呋喃-0.2%枸橼酸（14∶1∶85）为流动相，在流速为1.0ml・min-1，360 nm的检测波长下，对三棱超临界萃取物中芦丁含量测定进行系统研究。建立的方法在芦丁浓度为0.003 40～0.024 32 mg・ml-1的范围内线性关系良好，样品在8 h内稳定，平均加样回收率为98.56%，方法具有很高的精密度，适用于检测三棱中芦丁的含量。

　　【参考文献】

　　［1］陈兔林，陶学勤，叶定江. 气质联用法分析炮制对三棱挥发油的影响［J］. 中成药，1999，21（1）：22.

　　［2］毛淑杰，沈红. 三棱不同炮制品黄酮成分含量测定［J］. 中国中药杂志，1999，24（1）：29.

　　［3］毛春芹，陆兔林，邱鲁婴. 三棱不同炮制品总黄酮镇痛作用研究［J］.南京中医药大学学报（自然科学版），2001，17（9）：5.

　　［4］陈兔林，毛春芹，叶定江，等. 三棱总黄酮抗血小板聚集及抗血栓作用研究［J］. 中草药，1999，30（6）：439.

　　［5］徐立春,孙震华. 三棱、莪术提取物修饰的肿瘤细胞疫苗的非特异性抗瘤实验研究［J］. 癌症，2001，20（20）：1880.

　　［6］张卫东，王永红，秦路平. 中药三棱黄酮类成分的研究［J］. 中国中药杂志，1996，21（9）：550.