改良双抗体夹心法 结果帮忙分析一下，感激不尽
丁香园
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我现在做elisa，目的是利用此法来检测我样品中蛋白的浓度，我用的是改良的双抗体夹心法，就是包被鼠单抗，加标准品和待测样品，再加兔多抗，再加山羊抗兔的酶标二抗，TMB显色。我现在的问题是摸索单抗和多抗的稀释度，所以就将多抗稀释了三个浓度1:5000,1:10000,1:15000,1:20000，单抗 包被稀释度是1:15000，标准品都是五倍稀释即：25μg/mL , 5μg/mL , 1μg/mL , 0.2μg/mL , 0.04μg/mL 酶标二抗是1:5000
双波长A450/A650检测得到的结果如下
麻烦大家帮我分析一下：
1:5000 1:10000 1:15000 1:20000
25μg/mL 3.460 3.268 2.922 3.135
5μg/mL 3.122 3.076 2.900 2.36
1μg/mL 3.031 1.747 1.280 0.876
0.2μg/mL 0.299 0.181 0.138 0.103
0.04μg/mL 0.114 0.081 0.074 0.077
阴性 0.095 0.078 0.074 0.069
空白 0.052 0.054 0.054 0.055
我看很多网友说阳性/阴性>2时，说明单抗和多抗比例最佳，请大家帮我分析一下，我这个多抗浓度用哪个合适？
我自己认为1:5000 和1:10000浓度过高，因为 5μg/mL时已经达到了上限，说明多抗过量或样品也过量，我不知道我这样理解对不对？我晚上又包被了一块板子，我想是不是我的标准品浓度应该再往下稀释，我计划明天标准品稀释为5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.156, 0.07（倍比稀释）多抗准备做个1:20000， 1:25000， 1：30000
大家帮我看看是否合理，怎么改进？
我先交代下我的具体步骤：
1. 包被单抗，4°过夜
2.洗板机洗版5次
3. 封闭5%小牛血清+PBS-T 37° 水浴 2h
4. 标准品 37°水浴 1h
5. 洗板机洗版5次
6.加多抗 37°水浴 1h（多抗是稀释在封闭液中）
7. 洗板机洗版5次
8.酶标二抗（稀释在封闭液中）37°水浴 1h
9.洗板机洗版5次
10.TMB室温显色20min，加2M硫酸终止
11. 检测A450/A650
双波长A450/A650检测得到的结果如下
麻烦大家帮我分析一下：
1:5000 1:10000 1:15000 1:20000
25μg/mL 3.460 3.268 2.922 3.135
5μg/mL 3.122 3.076 2.900 2.36
1μg/mL 3.031 1.747 1.280 0.876
0.2μg/mL 0.299 0.181 0.138 0.103
0.04μg/mL 0.114 0.081 0.074 0.077
阴性 0.095 0.078 0.074 0.069
空白 0.052 0.054 0.054 0.055
我看很多网友说阳性/阴性>2时，说明单抗和多抗比例最佳，请大家帮我分析一下，我这个多抗浓度用哪个合适？
我自己认为1:5000 和1:10000浓度过高，因为 5μg/mL时已经达到了上限，说明多抗过量或样品也过量，我不知道我这样理解对不对？我晚上又包被了一块板子，我想是不是我的标准品浓度应该再往下稀释，我计划明天标准品稀释为5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.156, 0.07（倍比稀释）多抗准备做个1:20000， 1:25000， 1：30000
大家帮我看看是否合理，怎么改进？
我先交代下我的具体步骤：
1. 包被单抗，4°过夜
2.洗板机洗版5次
3. 封闭5%小牛血清+PBS-T 37° 水浴 2h
4. 标准品 37°水浴 1h
5. 洗板机洗版5次
6.加多抗 37°水浴 1h（多抗是稀释在封闭液中）
7. 洗板机洗版5次
8.酶标二抗（稀释在封闭液中）37°水浴 1h
9.洗板机洗版5次
10.TMB室温显色20min，加2M硫酸终止
11. 检测A450/A650
