实时定量PCR用于基因的定量分离
丁香园论坛
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实时定量PCR用于基因的定量分离
——正在兴起的一项技术
前言：目前许多关于定量PCR的实验报道证实了定量PCR由一门实验技术向科学研究的大的方向的转变。定量PCR有许多用途：测量mRNA表达的水平，DNA的拷贝数目，转基因的拷贝数目和表达分析，等位基因的鉴定和测量滤过性病毒的浓度测定。实时定量PCR的用途的应用范围非常广阔，而且它能够对菌种的增殖过程中低成本的反应器和反应物进行检测。成功的运用实时定量PCR并不是需要耗费很大的资金。这一篇综述能够通过限制这种技术的多种因素的分析来引导读者。对实验设计，模板准备，分析方法仔细的考虑对于精确的基因定量分析是非常重要的。
正文：在网上通过搜索关键词“定量PCR”或者“实时PCR”可以得到几千个结果，这足可以证明这项技术已经成为许多科学领域的主流研究方向。如果同一个搜索要在几年以前完成，那么得到的搜索结果只有几百个。是什么原因使得运用这种实验技术的论文增加的如此之快呢？第一个有关于实时PCR的文献发表于1993年[1]，那个时候这种实验技术还没有成为主流的实验技术。最主要的原因可能是实验仪器资金上巨大的耗费，而且在运用实时定量PCR研究可增殖的对象时候麻烦会更多，而实时PCR最近才被广泛的运用为一项有用的技术。随着市场上实时PCR仪器越来越多，这类仪器和反应物的价格也越来越便宜，更多的人现在选择了这项技术。将标准PCR甚至半定量PCR的知识简单的拓展已经不足以设计和分析这类试验。在运用实时PCR时候再也不是仅仅看到凝胶上面的一个条带就足以了，要得到一个确定的结果还需要更多调控。
PCR反应能够对模范链进行指数似的拷贝。由于反应过程中模板，反应物的限制，或焦磷酸分子产物对于DNA聚合酶的抑制作用，以至PCR反应最后不能够指数似的拷贝模板，而且其他反应的产物会产生比目的产物更多。这是为什么PCR反应终止时候的产量总是难以确定。能够对在PCR反应正在聚集的过程中产量的进行测量，或者能够实时的测量，那么就能够在PCR指数期反应的时候测量某一个点的产物的量。也只有通过指数期反应外推回去才能够知道起始的模板的数量。在实时PCR反应的指数期通过所有样品的比较而确定了一个荧光信号起始值。这个起始值能够作为参照的荧光值,并且当样品信号明显的大于参照的荧光值这个荧光信号起始值就被绘在图上。因此，PCR循环的每一个部分需要产生足够的荧光信号才能够达到这个起始值所经历的循环数目，或者Ct（cycle threshold）。Ct值正比于起始的模板的数量而且也是计算mRNA表达水平或者DNA拷贝数的计算的基础。
什么是实时定量PCR？
实时定量PCR是对聚合酶链式中正比于反应前模板数量的反应产物的一种可靠的检测方法和测量方式。要达到这个目的，需要有一种检测PCR反应聚集产物的方法和一台能够执行热循环并且能够实时记录每一个PCR循环结果的仪器。在实时PCR仪器问世以前，要完成定量PCR，需要在以经验判断PCR循环的数目内用溴化乙锭（Ethidium Bromide）（或者其他的能够插入碱基的染料）插入DNA碱基对之间将PCR产物可视化。这些产物需要在标准的琼脂糖凝胶上跑电泳还要通过光电成像或者其他的密度测量方式使产物量化。后来极具竞争力的PCR反应拥有一些定量的能力，但是即便拥有这些办法仍然还不能够称为方便，稳定，可以信赖的定量方法。
第一篇报道实时PCR的实验，1993年Higuchi在PCR反应过程中通过溴化乙锭的插入和一台经过改良的热循环仪，用UV射线照射样品然后通过CCD相机检测产生的荧光值。检测的荧光信号值被作为检测PCR反应周期的一种手段。经过绘图的结果（如图1所示），该图对PCR每一个循环的产物数量给予了一个很好的预测（除了那些早期循环时候荧光信号值处于CCD相机识别范围以下）。这种方法的主要缺陷，不是采用强烈致癌物类似于溴化
图一：一个假设的扩增图谱阐明了实时定量PCR实验中术语的应用。这个扩增图以荧光信号和PCR循环数目为轴作图。基线是指信号开始聚集的PCR循环数而位于仪器的识别范围之内。在PCR循环中测量的信号用于绘制起始值。起始值一般为对应荧光信号基线平均信号值的标准偏移值的10倍。在标准值上方被发现的荧光信号能够被用来定义一个样品的起始周期（Ct）。Ct值定义为每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。不同样品的Ct值用于计算每一个样品的相应的模板含量。图中实线跨过PCR循环数目18的起始值点划线跨过PCR循环数为20的起始值。用20减18，那么两个样品有2个循环的差别或者说△Ct＝2。由于PCR反应指数式增长的本质，△Ct值要减2或者将差值乘4才能够将△Ct线形化。这种算法用于相对定量分析。
乙锭，而在于一些非特异的PCR产物同样被检测到而包含在被测的荧光信号值总量之中。
现今，化学方法通常采用5′核酸酶方法，用到TaqMan探针，分子标记，SYBR Green I插入碱基的染料。还报道了一些其他的方法；但是在任何情况下，在PCR反应过程中产生的荧光信号能够被各种不同的实时的PCR仪所吸收。由于这种额外的特异性，增加一个杂交的探针能够使得实时定量PCR更加的稳定。5′核酸酶方法通过裂解5′靶位点的寡聚核苷酸而产生荧光信号（TaqMan 探针，Applied Biosystems，CA，USA）。Applied Biosystems采用了一种新型号的TaqMan探针，该系统在3′使用“DNA双链小沟结合（MGB）”从而降低探针的解链温度，因此使得探针能够明显的变得更短并增强探针在等位基因识别中的作用。此外，这些探针能够判定一个特异的等位基因的表达水平达到排除仅仅只有一个核苷酸差别的对应的等位基因（未正式出版的报道）
目前市场上有许多中实时PCR仪；其中包括ABI7700，BI7900，BI7000 (Applied Biosystems)，MX4000 (Stratagene，aJolla，CA，USA)，Lightcycler (Roche，Alameda，CA,USA)，iCycler (Bio-Rad，Hercules，CA，USA)，Smartcycler(Cepheid，Sunnyvale，CA，USA)， Robocycler (MJ Research，Incline Village，NV，USA).目前最常见的,并第一个被大量投入市场的机器是ABI7700，它已被ABI7000 和ABI7900所取代。ABI系列仪器的主要优点在于它能够采集“被动参照”信号数值并能够在反应系统中对每一次反应光学变化规格化。MX4000也能够通过软件轻易的完成对每一个变化值进行补偿，它还能够完成多元反应，最多能够在一个试管中完成三个不同的PCR反应。虽然对比和比较市场上所有的仪器已经超出了这片综述文章的讨论范围，但是必须要清楚什么时候买什么型号的仪器。所有这些仪器都能够完成实时PCR，然而他们不都是一样的。在做选择的时候花费不是唯一的因素；便宜一些的仪器不能够对光学变化值进行补偿因而不能够检测出微小的变化。高产量的器材可能超过你的需求（例如AB7900）；它拥有384个孔洞，它能够实施大批量的等位基因检测。做出选择时候你需要极大的小心和调查；有必要依据你的需要比较各种仪器的性能。
定量PCR的一般运用
实时定量PCR的用途是非常多的。这些用途包含：mRNA表达研究，基因组DNA和滤过性病毒DNA拷贝数的测量，转基因拷贝数，等位基因识别实验，基因微阵列数据的证实。还有一些最新的用途，包括特异结合不同基因的表达分析和激光捕捉显微解剖物质；石蜡包埋组织；分化细胞（包括干细胞）；或者单细胞中随即扩增的RNA ，这些应用表现了这项技术运用于限量样品的表达分析研究的灵敏度。
图二：在实时定量PCR中产生荧光信号的。虽然还有其他的办法，但是这种办法在实时定量PCR中是最常用的。（A）在5′核酸酶方法利用Taq DNA聚合酶5′到3′外切酶活性，典型的TaqMan探针产生信号。这种探针能够在标准的PCR引物之间杂交模板。与其他的探针裂开之后，5′染料分子在接近淬火分子例如TAMRA（6－四甲基若丹明）时候发生淬火反应而发生脱离。5′染料分子可以采用不同的分子而6－FAM分子一般是最常用的。（B）分子标记。这个类似于TaqMan探针，它使用淬火的方式来避免一些不要的荧光信号，虽然采用直接的能量传输方式。但是，不同的是，在和模板杂交的时候它不是通过5′外切酶活性而裂开的。增加的发卡结构能够提供淬火效应。在杂交的时候，5′端的染料分子和淬火分子之间的距离（一般是DABCYL）要足够的大才能够才有最小的淬火信号。在PCR退火状态时候信号必须要分析。（C）SYBR Green I DNA结合染料。当采用这种办法时候没有必要设计第三个寡核苷酸或者杂交探针。在染料分子结合了DNA分子（通过此最佳状态的结合DNA双链），荧光信号只有在样品受到光源激活的时候才能够发射出荧光信号。这是这个办法最节约的地方，但是它不能够在使引物不形成引物二聚体这个方面优化PCR反应。SYBR Green I 染料不能够识别天然的模板和人造模板，不像TaqMan探针或者分子标记。
实时定量PCR运用于血液学实验的特殊用途
实时定量PCR已经用于一小部分此类研究中并且在一些杂志上发表。然而，随着目前实时定量PCR雨后春笋般地被运用研究中，它在血液学中发挥更大的潜力只是时间问题。典型的例子包括转基因产物的测量，白血病基因DNA拷贝数的测量，免疫反应细胞分化的关键基因mRNA表达水平的分析。
对于最小限度残余疾病的检测
血液肿瘤表现为基因的转移，能够用作肿瘤标记监控对治疗的反应。治疗的选择包括化学疗法，放射疗法，或者骨髓移植。通过这几十年的这些进步大大地增加了这些病人存活的几率。然而，复发仍然是完全康复的一大难题。因而，对于最小限度残余疾病的检测是进一步的改良治疗的方案的关键步骤[29，30]。实时定量PCR的应用已经成为检测这些复发症状的分子反应，并且能够从病人分子水平的表现来引导治疗的方案。因此定量的反应能够用于确定反应产物的量和临床治疗效果的关系。
有一个典型的例子，急性成瘤细胞白血病转录因子（AML）－1于第8号染色体发生融合，这被称之为倒位t(8;21)(q22;q22)，很有可能就是AML疾病中主要的染色体畸变。这种由AML－1普通的转录水平的调控所造成的畸变很有可能导致了白血病的发生。虽然对于许多AML病人有着可喜的治疗成果,但是很大比例的病人又旧病复发。而且，那些没有复发的病人采用标PCR反应对于AML－1/MTG－8转录融合反应结果仍然是阳性。这可能受限于难以发现微量的白血病前期细胞，标准PCR反应技术不能够满足病人，因为融和产物的量可能是更好的一种指示剂。因此，目前的研究[31，32]已经展示出实时定量PCR用来检测融和产物有助于鉴别那些病人可计量的最小限度残余疾病，并且对于指示剂和治疗方案选择的估计都证实是有价值的。
类似的研究也应用于其他的转座融合转录产物的量化，例如BCR－ABL在慢性骨髓白血病（CML）[33，34]中决定了CML病人[36]对于α－干扰素的反应。将白血病特化端粒－AML-1融合的转录水量化用于儿童急性成淋巴细胞白血病（ALL）复发的预测或者测量最小限度残余ALL疾病，可以采用定量PCR的办法。此外，实时定量PCR已经用于量化染色体转位t(14;18)(q32;q21)[40,41]；卵泡淋巴瘤（FL）病人bcl-2基因的重组；或者干细胞治疗非霍奇金氏淋巴瘤的效果。这种办法也能够应用对普通人外周血液中bcl-2基因的重组从而作为判断这种背景重组水平怎样影响鉴定患有卵泡淋巴瘤（FL）的病人[43]。许多这类的研究都很大程度上受益于实时定量这种方法的应用。随着高度灵敏定量PCR实验手段的采用，将分子的反应关联作为临床诊断可能现在就实现了。
白血病DNA拷贝数的测量
DNA拷贝数的测量对于判定引发许多恶性肿瘤的染色体不平衡的程度是很重要的。有许多种办法测量肿瘤的DNA拷贝数；每种办法都有特定的优点和缺点。染色体组CGH能够探测整个染色体的不平衡性，但是分辨率很低。荧光原位杂交（FISH）对特异行为的细胞提供拷贝数的测量，但是原位杂交不能够大批量的完成而且也很难测量25拷贝数以上的DNA拷贝。PCR反应能够采用简单多重重复序列的重复来鉴定等位基因的不平衡。然而，如果这是一个PCR终止反应，定量的结论将会是错误的。
实时定量PCR已经用于鉴定等位基因的不平衡的许多研究之中[11,12,44,45]。在不同部位的特定基因或者标记DNA拷贝数的定量法列举了染色体不平衡的部位。在定义定量微卫星基因这种技术，一种白血病动物模型曾经用于定义老鼠的第二染色体上的普通的染色体缺失，这一条染色体类似于人类的白血病相关的染色体。将SJL品系的老鼠在电离射线的照射下暴露，染色体受到破坏，包括第二染色体也发生破坏，而且许多这样的老鼠都会患上白血病。这些缺失部位的基因对控制细胞的增值很可能有重要作用，并且这些基因的识别有助于阐明导致癌症发生的分子事件的模型体系，这些分子事件则是反过来着眼于与白血病病人相关的基因。因为这个区域非常大（～23cM），那么运用能够检测许多部位的方法QuMA能够有助于更进一步减少这些老鼠最小的普通缺失基因。
胞质分裂的表达分析
可信的细胞运动相关的mRNA定量表达轮廓对于分析特殊的免疫反应是很重要的[46]。准确的细胞运动水平的定量表达有助于检测免疫学反应。细胞运动在自体免疫，过敏反应，疾病传染又如炎症的引发和消炎反应[47]。另外，细胞运动一般着重于研究器官移植的抑制免疫力治疗方法。细胞运动在一些长期的发炎疾病中起着缓解作用，例如风湿性关节炎。与胞质分裂类似，不同细胞类型的化学增活现象和化学增活受体的表达水平对于更加深刻理解化学信号的运动过程是至关重要。定量PCR的使用已经很大程度地改善了细胞运动和化学信号在许许多多生物类论文中的地位。
设计稳定的实时定量PCR反应的标准
采用实时定量PCR做研究的最好方法取决于所要解决的科学问题。第一个区分点在于这项研究是否着眼于mRNA的表达水平（采用定量反转录PCR）或者DNA的拷贝数。其他的因素例如基因的数目，所覆盖的样品的数目都影响方法的选择。对于发射荧光信号，引物设计和鉴定，设计实时定量PCR反应的选择在下文介绍。
实验设计
有两种定量PCR的分析：“相对定量”和“标准曲线定量”。后者也被称为“完全定量”[49]；但是，这其实是用词不当。更准确的说法是标准曲线定量（五成或者十成连续稀释），就是以一条已知的标准曲线求得未知值。这种方法依赖于一些已知值，这就是它不可能为完全的原因。无论被鉴定的对象是什么，鉴定的方法多么仔细，还是没有办法知道在一个已知的样品到底有多少个拷贝。
相对定量是许多实时定量PCR研究的分析方法的一种选择。这种办法中，样品（DNA，cDNA）对照是指目的基因与一个调控基因实现的。定量的数值是将数值都对应地减去调控基因的循环基值，或者称为Ct，就是目的基因减去调控基因，因而循环之间的差值（ΔCt）为2（由于PCR反应的本质决定的），表明了这两个基因的模板的扩增倍数不同。与调控基因的比较存在着正值和负值。这种设想必须保证选中的调控基因在被研究的样品中拷贝数目和表达水平没有发生变化。如果这种设想能够成立，那么更多的样品能够在给定的托盘上或者多重托盘上进行实验这样就使得样品能够充分的相比较。将各种反应物适当地混合并且采用阳极移液枪头，这样就能够使每一个PCR管中各种模板的含量非常的相似。每个基因的每个样品三分之一的检测中的变化能够每个样品中基因含量的差别。
采用相对定量法要求所有基因PCR反应的效率要相似，并且最好大于或者等于90%。这能够通过将正控制模板10倍连续稀释，以模板浓度值的log[10]对数值绘制Ct曲线；曲线的斜率可以看作PCR反应的效率。斜率为-3.32表示PCR反应效率为100%（Fig.3）。相对于PCR效率100%的偏移值能够通过将斜率（S）代入下面的公式来求得： 。关于这方面的细节和其他的计算方法请看[11，12，50]。影响PCR反应效率变化的因素主要是MgCl2，引物，和探针的浓度。如果可以的话，最好维持一个稳定的退火温度，这样所有的PCR反应能够在同样的反应条件下进行。
图三 ：一个假设的标准曲线用于PCR效率和定量的计算。一般采用5倍稀释或者10倍稀释来绘制标准曲线。对于每一个输入的模板含量得到的Ct值可作为输入含量的Log[10]对数值的函数，得到直线能够符合数据。这样做能够优化PCR反应的效率并且能够对未知点进行定量（如图所示的灰色的点）。确定PCR反应的效率对于相对定量十分重要。得到符合数据的直线斜率可以通过图中的公式来计算PCR反应的效率。效率为100%的PCR反应斜率值为-3.32；该例子中效率为97%。确定该斜率的函数也能够用于计算未知样品的含量。大多数实时PCR仪都能够从一个标准曲线中依靠软件计算出未知样品中模板的含量。但是，也能够人工地将观测的Ct值代入公式：（observed Ct－y intercept）/slope。如果计算的PCR反应的效率大于100%，那么可能因为已知样品吸取值不准确，或者标准中有PCR抑制物。如果这种情况发生而又没有被发现（不能够执行PCR反应效率公式），在使用标准曲线定量方法时候，由于没有吸取准确或者没有同样的PCR反应的抑制物会造成对未知值计算值过高。
标准定量曲线法在少量或者大量的样品中测定小量基因或者计算滤过性病毒颗粒的数目时候能够成功的运用。使用这种方法没有必要做仔细地优化；但是最好采用高PCR反应效率的实验。并不是完全都需要一个调控基因，但是对未知物质的控制和加量小心地定量对于得到准确结果非常重要。加入一个调控基因有助于判断是否发生明显吸量错误。已知样品的标准曲线对于每一个托盘上的每一个基因是必要的，并且这个标准曲线能够正好横跨未知物质含量的上下。最普遍的已知样品来源即目的基因质粒，标准曲线是以起点含量的连续稀释而得到的，该起点含量可以通过分光光度计，荧光计，或者Pico Green（一种分子探针，Eugene，美国产）。如果没有质粒，还有另外一个选择能够更容易的获得标准曲线，就是对整个扩增元全部采用人工合成寡聚核苷酸。然而这种办法仅仅当扩增元小于100bp。但是，由于寡聚核苷酸的相对比较纯，在使用分光光度计定量时候能够较少的产生偏差。此外，标准值的准确测量和寡聚核苷酸物质的量的计算的可能性，都使得估计未知样品的拷贝数（不是确切的拷贝数目）成为可能。标准曲线最后一个选择是采用目的基因的拷贝数或者表达水平。未知样品可以从由三种来源产生的标准曲线容易地定量（图二）。
寡聚核苷酸的设计
Applied Biosystems中的Primer Express寡聚核苷酸设计软件可能是目前设计实时定量PCR反应所用寡聚核苷酸时候使用得最广泛的。能够设计出高效率反应的实验。Primer3是麻省理工大学设计的免费软件（见表一），这种软件也能够用于设计实时PCR反应，还包括设计插入内部的杂交探针。不考虑使用何种软件，最重要的就是实验的设计。如果采用SYBR Green I方法，PCR引物一定不能够形成一点点引物二聚体。每一个产物的熔点曲线可以用来保证荧光信号是最理想的PCR产物发生的。在mRNA表达实验中使用杂交探针，探针的序列应该包含外显子，可能的话包含外显子外延（图四）。并且，查阅基因组文库的扩增元序列能够保证实验的设计没有探测假基因。PCR产物的扩增元应该适当的小一些，杂交探针为70～150bp，STBR Green实验中采用小于300bp探针。
表一 有用的一些站点和链接：
设计用于mRNA表达水平检测的实时定量PCR实验
设计一个理想的实时定量PCR实验包含引物的选择，因为引物决定了扩增产物与
mRNA是相应的，并且不会扩增基因组DNA。如果采用SYBER-Green I染料，将会很麻烦但还是可以的。PCR引物其中的一个必需要包含内含子，这样引物3′端5～6个核苷酸能够与基因的外显子杂交，使得剩余部分能够与相临的外显子杂交。如图四A所示，这样的设计可以使污染的基因组DNA难以扩增。另一个更加典型的设计（如图四B），使用一个TaqMan探针或者一个分子标记，杂交探针跨越两个外显子的交接点，使它不能够识别基因组DNA。
核酸的纯化和cDNA的合成
在定量PCR反应中使用的核酸的纯度对于得到一个可以重复的结果是至关重要的。对于定量PCR实验最普遍的来源是细胞培养或者血液的产物。目前的可以使用的商业方法和试剂盒足以生成纯净的核酸样品。要注意的是在Chomczynski & Sacchi法中使用苯酚/氯仿混合溶液时候，任何一点点苯酚都会降低反转录的效率。此外，在使用紫外分光光度计定量时候，苯酚会造成样品中RNA测量得过多，因为苯酚也会吸收紫外光。其他的组织特异性污染物会造成反转录效率降低，甚至会非常低。
有许多篇关于从石蜡包埋的组织中抽取RNA用作实时定量PCR实验的报告；这种办法虽然很落伍，但还是实用的。然而，RNA的纯度对于获得好的数据是非常重要的。在这些研究中[22，23，52]，纯化RNA仍然耗费了大量的精力，例如利用K蛋白酶做三天的培养，尽量去除交联蛋白，尽管这种办法很落伍，这样得到的RNA非常纯。那些随即降解的RNA小片段对于实验没有坏的影响，因为实验中这些扩增元非常短。
对RNA样品中加入DNase酶进行处理是一部非常普通的步骤；但是，如果实验设计中杂交探针还会跨越外显子与外显子的交界处，那么就不需要这一步。如果实在没有其他的办法，在cDNA合成的前必需要经过DNase酶处理这一步，例如没有内含子的基因，目前最好的产品是Ambion公司的“DNA free”（Austin，TX，USA）。它能在溶液中进行DNA酶解而不需要进行热失活或者进一步的RNA沉淀。
实时定量PCR反应的另一个容易被人忽视的因素是反转录这一步。如果这一步不够仔细，会引入一些杂质，会阻碍正确地表达分析。不同的选择办法可以产生不同的cDNA：随机六聚体，寡聚核苷酸，或者运用许多种逆转录酶（RT）起始特异的基因。一般偏好的制备cDNA的方法是将整个RNA在MMLV逆转录酶作用下以随机引物起始而生成的。使用随机六聚体能够在制备cDNA时候产生最小偏差并且对相对定量法和绝对定量法有影响。此外，它同样也能够在后续的实验中检测其他基因，在运用相对定量法的时候也能够直接反映前一个研究对象的表达水平。在仅仅使用基因特异的引物或者寡聚核苷酸由RNA生成cDNA时候，可能会发生差异。特定序列的相互作用，如引物和RNA的发夹结构都可能使得某一些序列特异的引物比其他的引物更高的反转录效率。在使用标准曲线定量法对任何给定基因定量时候，这不是一个很明显的问题，但是在比较不同基因之间特别是使用相对定量法时候，这会是产生偏差的显著原因。然而，由于RNA的二级结构和poly A尾巴，使用寡聚胸腺嘧啶（oligo-dT）引物能够产生统计有偏的产物，这样也排除了在相对定量法中将18S 核糖体基因作为调控基因。扩增元距离poly A尾巴或者基因特异反转录酶起始位点的距离，在运用相对定量法中并且也只会在比较一个基因和另一个基因表达水平时候会产生错误。
两步法反转录PCR（RT－PCR）反应中，RT－PCR反应在一个独立于PCR反应以外的试管中进行。而一步法反转录PCR反应这两种反应在一个试管中进行。首先，两步法产生的cDNA能够运用于许多不用基因的不同实验，并且能够较少的对RNA进行操作，对RNA进行操作会造成降解。一步法的主要优势在于在同样的试管中运用两种不同“着色”的探针使得两个独立的PCR反应在一个多元反应系统中进行。这样能够保证两个反应都能够在确切的相同含量的cDNA下进行，然而这也可以通过将所有的反应组分除了引物和探针或者标记（后加）娴熟地混合来实现。一步法的第二个优势可能在于增加了实验的灵敏性，因为在同一个试管中反转录反应中所有的RNA也就是马上进行PCR反应的RNA。但是，一步法外加的一个复杂因素是在同一个环境中PCR反应和其他反应之间的相互作用和影响。如果一个基因比另一个基因有高得多的表达水平，PCR反应中由于高表达的基因能够抑制第二个PCR反应产生信号而造成试剂的局限性或者焦磷酸盐( 或酯)的聚集。此外，两个不同探针的光谱交叠会影响每个基因的定量。
图四：实时PCR反应典型基因引物A和杂交探针或者引物B的首选位置。该例上排是以基因组基团绘制的外显子（黑色矩形）和内含子（细线）；下排绘制了当“外显子－外显子”交界处转变成cDNA时候，mRNA变化过程。A图，设计的PCR引物（黑色箭头）跨越了基因组的一个内含子，引物3′端5～6个核苷酸补充临近的外显子。大片内含子的区域阻碍了引物对基因组DNA模板的聚合酶反应的起始。如果引物能够连接前后的cDNA，那么引物就能够起始PCR反应并且能够对cDNA提供特异性从而减少了污染的基因组DNA经PCR反应生成产物的机会。图B，类似的设计，图示的额外的双向探针或者分子标记跨越外显子与外显子之间的交叉点（小斑纹矩形和小斑纹圆圈代表荧光信号），因而对实时定量PCR反应提供了更多的特异性，因为荧光信号仅仅在引物起始cDNA模板才能产生。这是实时定量PCR反应的最佳设计，因为它简化了RNA的纯化过程因为它避免了DNase I处理这一步同样也减少了无效起始而产生的可识别信号，因为这在不使用杂交探针时候可能发生。
设计计算DNA拷贝数目的定量PCR反应
设计计算DNA拷贝数目或者滤过性病毒颗粒数目的定量PCR反应，一个好的实验设计较实时定量PCR 要考虑的因素少的多。扩增元要设计得要么在一个外显子中，要么包含在相对于基因组DNA特意的内含子的一部分。相对定量法和标准曲线定量法都可以使用。用于生成标准曲线的标准可以由实时定量PCR反应获得，但是相对定量法中内生调控基因的选择可以不同。出了使用两个拷贝数的已知基因，在微卫星标记侧面的引物的聚合体可以作为“调控基因”来减少非整倍样品中任何给定位点的过高过低估计，例如癌细胞。以固定的陈品和新鲜样品制备模板，DNA的纯度是首要的问题[50]。理想情况下，每一个DNA样品应该用过一个标准曲线确定是否存在任何PCR反应的抑制物，该抑制物会阻碍正确地定量。
定量PCR的局限
两种分析方法即相对定量法和标准曲线定量法都有明显的缺陷和潜在的不足。在使用标准曲线定量法时候，每一个基因都需要一个标准曲线，而这个标准曲线在96孔的托盘上会占据很多的空间。但是，使用384孔的AB7900型PCR仪，这就不是问题了。标准曲线的绘制需要质粒,寡聚核苷酸和其它源料，这无疑是额外的要求并且会造成差别，使得不同托盘上的数据难以比较。额外的托盘控制能够减少这种差别，但是它也会减少在每个托盘上可以进行实验的样品数目。此外，用于产生标准曲线的样品会发生变化并且使得那些数据没有规格划到标准细胞水平的实验室的数据难以比较。使用标准曲线法，在反转录这一步额外源料会造成错误，因为不同的RNA样品有着不同的反转录效率。虽然有这些缺点，标准曲线法仍然是一种有用的办法。对于一个小型的实验，它能够很快的准备并且进行实验而不需要很多额外实验优化，虽然PCR反应效率要求合适地计划和尽可能地优化。当然，这并不是依赖于内生调控基因不受实验条件影响的假说。
当有许多样品进行多种基因的鉴定时候，最好采用相对定量法。通常，每一个待测样品仅需要一个系列的孔(一般是三个一组)，这样能够在一个托盘上最大限度地进行样品鉴定。虽然相对定量法依赖于内生调控基因不受实验条件影响的假说，但是如果这种影响是很明显的话也是可以测定的。这能够通过对含有多个备选的内生调控基因的许多待测样品定量来实现。通过起始模板的仔细定量（使用RiboGreen I 或者PicoGreen，分子探针，Eugene公司，USA），并且使用被证实为线性的反转录方法，那么就可能确定在既定实验条件下的样品中任何可能的调控基因被作为有效地内生控制时是否充分一致。虽然这仅仅是一个近似值，它应该还可以对这些明显受到实验条件影响的备选调控基因进行定义。调控基因已经成功地应用于β-葡(萄)糖苷酸酶，GAPDH，18S rRNA，组蛋白 3.3a，泛醌等等的定量。
实时定量PCR反应的展望
既然实时定量PCR已经成为了科学研究的主流，那么这项技术的前景应用是非常令人兴奋的。最受关注的是将实时PCR与高级微型解剖技术，或者石蜡包埋储存样品的核酸，或者少量细胞完全转录扩增相结合。对难以分离的微量特异类型细胞测量基因表达水平或者DNA拷贝数目是可行的。定量PCR其他喜人的发展将会出现在实时技术应用于临床案例分析有助于临床医生对病人分层对待。最小限度残余疾病的识别和分析，滤过性毒菌的装载都将继续是研究的重要渠道。此外，细胞衍生的生物分子安全性的确定和类似逆转录病毒颗粒定量的地位会随着实时定量PCR反应而增强。其他的应用有助于鉴别治疗用重组mAbs生产时产生的潜在污染。将胚胎细胞或者母体循环的DNA分类技术与定量PCR技术结合能够让天生畸形的产前诊断使用最低限度的应对措施。实时PCR技术的应用能够继续进行基因芯片挑选基因的表达水平的确认。使用MGB探针，特异等位基因的表达分析还有极为特殊的生化武器证据甄别都成为可能。
——正在兴起的一项技术
前言：目前许多关于定量PCR的实验报道证实了定量PCR由一门实验技术向科学研究的大的方向的转变。定量PCR有许多用途：测量mRNA表达的水平，DNA的拷贝数目，转基因的拷贝数目和表达分析，等位基因的鉴定和测量滤过性病毒的浓度测定。实时定量PCR的用途的应用范围非常广阔，而且它能够对菌种的增殖过程中低成本的反应器和反应物进行检测。成功的运用实时定量PCR并不是需要耗费很大的资金。这一篇综述能够通过限制这种技术的多种因素的分析来引导读者。对实验设计，模板准备，分析方法仔细的考虑对于精确的基因定量分析是非常重要的。
正文：在网上通过搜索关键词“定量PCR”或者“实时PCR”可以得到几千个结果，这足可以证明这项技术已经成为许多科学领域的主流研究方向。如果同一个搜索要在几年以前完成，那么得到的搜索结果只有几百个。是什么原因使得运用这种实验技术的论文增加的如此之快呢？第一个有关于实时PCR的文献发表于1993年[1]，那个时候这种实验技术还没有成为主流的实验技术。最主要的原因可能是实验仪器资金上巨大的耗费，而且在运用实时定量PCR研究可增殖的对象时候麻烦会更多，而实时PCR最近才被广泛的运用为一项有用的技术。随着市场上实时PCR仪器越来越多，这类仪器和反应物的价格也越来越便宜，更多的人现在选择了这项技术。将标准PCR甚至半定量PCR的知识简单的拓展已经不足以设计和分析这类试验。在运用实时PCR时候再也不是仅仅看到凝胶上面的一个条带就足以了，要得到一个确定的结果还需要更多调控。
PCR反应能够对模范链进行指数似的拷贝。由于反应过程中模板，反应物的限制，或焦磷酸分子产物对于DNA聚合酶的抑制作用，以至PCR反应最后不能够指数似的拷贝模板，而且其他反应的产物会产生比目的产物更多。这是为什么PCR反应终止时候的产量总是难以确定。能够对在PCR反应正在聚集的过程中产量的进行测量，或者能够实时的测量，那么就能够在PCR指数期反应的时候测量某一个点的产物的量。也只有通过指数期反应外推回去才能够知道起始的模板的数量。在实时PCR反应的指数期通过所有样品的比较而确定了一个荧光信号起始值。这个起始值能够作为参照的荧光值,并且当样品信号明显的大于参照的荧光值这个荧光信号起始值就被绘在图上。因此，PCR循环的每一个部分需要产生足够的荧光信号才能够达到这个起始值所经历的循环数目，或者Ct（cycle threshold）。Ct值正比于起始的模板的数量而且也是计算mRNA表达水平或者DNA拷贝数的计算的基础。
什么是实时定量PCR？
实时定量PCR是对聚合酶链式中正比于反应前模板数量的反应产物的一种可靠的检测方法和测量方式。要达到这个目的，需要有一种检测PCR反应聚集产物的方法和一台能够执行热循环并且能够实时记录每一个PCR循环结果的仪器。在实时PCR仪器问世以前，要完成定量PCR，需要在以经验判断PCR循环的数目内用溴化乙锭（Ethidium Bromide）（或者其他的能够插入碱基的染料）插入DNA碱基对之间将PCR产物可视化。这些产物需要在标准的琼脂糖凝胶上跑电泳还要通过光电成像或者其他的密度测量方式使产物量化。后来极具竞争力的PCR反应拥有一些定量的能力，但是即便拥有这些办法仍然还不能够称为方便，稳定，可以信赖的定量方法。
第一篇报道实时PCR的实验，1993年Higuchi在PCR反应过程中通过溴化乙锭的插入和一台经过改良的热循环仪，用UV射线照射样品然后通过CCD相机检测产生的荧光值。检测的荧光信号值被作为检测PCR反应周期的一种手段。经过绘图的结果（如图1所示），该图对PCR每一个循环的产物数量给予了一个很好的预测（除了那些早期循环时候荧光信号值处于CCD相机识别范围以下）。这种方法的主要缺陷，不是采用强烈致癌物类似于溴化
图一：一个假设的扩增图谱阐明了实时定量PCR实验中术语的应用。这个扩增图以荧光信号和PCR循环数目为轴作图。基线是指信号开始聚集的PCR循环数而位于仪器的识别范围之内。在PCR循环中测量的信号用于绘制起始值。起始值一般为对应荧光信号基线平均信号值的标准偏移值的10倍。在标准值上方被发现的荧光信号能够被用来定义一个样品的起始周期（Ct）。Ct值定义为每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。不同样品的Ct值用于计算每一个样品的相应的模板含量。图中实线跨过PCR循环数目18的起始值点划线跨过PCR循环数为20的起始值。用20减18，那么两个样品有2个循环的差别或者说△Ct＝2。由于PCR反应指数式增长的本质，△Ct值要减2或者将差值乘4才能够将△Ct线形化。这种算法用于相对定量分析。
乙锭，而在于一些非特异的PCR产物同样被检测到而包含在被测的荧光信号值总量之中。
现今，化学方法通常采用5′核酸酶方法，用到TaqMan探针，分子标记，SYBR Green I插入碱基的染料。还报道了一些其他的方法；但是在任何情况下，在PCR反应过程中产生的荧光信号能够被各种不同的实时的PCR仪所吸收。由于这种额外的特异性，增加一个杂交的探针能够使得实时定量PCR更加的稳定。5′核酸酶方法通过裂解5′靶位点的寡聚核苷酸而产生荧光信号（TaqMan 探针，Applied Biosystems，CA，USA）。Applied Biosystems采用了一种新型号的TaqMan探针，该系统在3′使用“DNA双链小沟结合（MGB）”从而降低探针的解链温度，因此使得探针能够明显的变得更短并增强探针在等位基因识别中的作用。此外，这些探针能够判定一个特异的等位基因的表达水平达到排除仅仅只有一个核苷酸差别的对应的等位基因（未正式出版的报道）
目前市场上有许多中实时PCR仪；其中包括ABI7700，BI7900，BI7000 (Applied Biosystems)，MX4000 (Stratagene，aJolla，CA，USA)，Lightcycler (Roche，Alameda，CA,USA)，iCycler (Bio-Rad，Hercules，CA，USA)，Smartcycler(Cepheid，Sunnyvale，CA，USA)， Robocycler (MJ Research，Incline Village，NV，USA).目前最常见的,并第一个被大量投入市场的机器是ABI7700，它已被ABI7000 和ABI7900所取代。ABI系列仪器的主要优点在于它能够采集“被动参照”信号数值并能够在反应系统中对每一次反应光学变化规格化。MX4000也能够通过软件轻易的完成对每一个变化值进行补偿，它还能够完成多元反应，最多能够在一个试管中完成三个不同的PCR反应。虽然对比和比较市场上所有的仪器已经超出了这片综述文章的讨论范围，但是必须要清楚什么时候买什么型号的仪器。所有这些仪器都能够完成实时PCR，然而他们不都是一样的。在做选择的时候花费不是唯一的因素；便宜一些的仪器不能够对光学变化值进行补偿因而不能够检测出微小的变化。高产量的器材可能超过你的需求（例如AB7900）；它拥有384个孔洞，它能够实施大批量的等位基因检测。做出选择时候你需要极大的小心和调查；有必要依据你的需要比较各种仪器的性能。
定量PCR的一般运用
实时定量PCR的用途是非常多的。这些用途包含：mRNA表达研究，基因组DNA和滤过性病毒DNA拷贝数的测量，转基因拷贝数，等位基因识别实验，基因微阵列数据的证实。还有一些最新的用途，包括特异结合不同基因的表达分析和激光捕捉显微解剖物质；石蜡包埋组织；分化细胞（包括干细胞）；或者单细胞中随即扩增的RNA ，这些应用表现了这项技术运用于限量样品的表达分析研究的灵敏度。
图二：在实时定量PCR中产生荧光信号的。虽然还有其他的办法，但是这种办法在实时定量PCR中是最常用的。（A）在5′核酸酶方法利用Taq DNA聚合酶5′到3′外切酶活性，典型的TaqMan探针产生信号。这种探针能够在标准的PCR引物之间杂交模板。与其他的探针裂开之后，5′染料分子在接近淬火分子例如TAMRA（6－四甲基若丹明）时候发生淬火反应而发生脱离。5′染料分子可以采用不同的分子而6－FAM分子一般是最常用的。（B）分子标记。这个类似于TaqMan探针，它使用淬火的方式来避免一些不要的荧光信号，虽然采用直接的能量传输方式。但是，不同的是，在和模板杂交的时候它不是通过5′外切酶活性而裂开的。增加的发卡结构能够提供淬火效应。在杂交的时候，5′端的染料分子和淬火分子之间的距离（一般是DABCYL）要足够的大才能够才有最小的淬火信号。在PCR退火状态时候信号必须要分析。（C）SYBR Green I DNA结合染料。当采用这种办法时候没有必要设计第三个寡核苷酸或者杂交探针。在染料分子结合了DNA分子（通过此最佳状态的结合DNA双链），荧光信号只有在样品受到光源激活的时候才能够发射出荧光信号。这是这个办法最节约的地方，但是它不能够在使引物不形成引物二聚体这个方面优化PCR反应。SYBR Green I 染料不能够识别天然的模板和人造模板，不像TaqMan探针或者分子标记。
实时定量PCR运用于血液学实验的特殊用途
实时定量PCR已经用于一小部分此类研究中并且在一些杂志上发表。然而，随着目前实时定量PCR雨后春笋般地被运用研究中，它在血液学中发挥更大的潜力只是时间问题。典型的例子包括转基因产物的测量，白血病基因DNA拷贝数的测量，免疫反应细胞分化的关键基因mRNA表达水平的分析。
对于最小限度残余疾病的检测
血液肿瘤表现为基因的转移，能够用作肿瘤标记监控对治疗的反应。治疗的选择包括化学疗法，放射疗法，或者骨髓移植。通过这几十年的这些进步大大地增加了这些病人存活的几率。然而，复发仍然是完全康复的一大难题。因而，对于最小限度残余疾病的检测是进一步的改良治疗的方案的关键步骤[29，30]。实时定量PCR的应用已经成为检测这些复发症状的分子反应，并且能够从病人分子水平的表现来引导治疗的方案。因此定量的反应能够用于确定反应产物的量和临床治疗效果的关系。
有一个典型的例子，急性成瘤细胞白血病转录因子（AML）－1于第8号染色体发生融合，这被称之为倒位t(8;21)(q22;q22)，很有可能就是AML疾病中主要的染色体畸变。这种由AML－1普通的转录水平的调控所造成的畸变很有可能导致了白血病的发生。虽然对于许多AML病人有着可喜的治疗成果,但是很大比例的病人又旧病复发。而且，那些没有复发的病人采用标PCR反应对于AML－1/MTG－8转录融合反应结果仍然是阳性。这可能受限于难以发现微量的白血病前期细胞，标准PCR反应技术不能够满足病人，因为融和产物的量可能是更好的一种指示剂。因此，目前的研究[31，32]已经展示出实时定量PCR用来检测融和产物有助于鉴别那些病人可计量的最小限度残余疾病，并且对于指示剂和治疗方案选择的估计都证实是有价值的。
类似的研究也应用于其他的转座融合转录产物的量化，例如BCR－ABL在慢性骨髓白血病（CML）[33，34]中决定了CML病人[36]对于α－干扰素的反应。将白血病特化端粒－AML-1融合的转录水量化用于儿童急性成淋巴细胞白血病（ALL）复发的预测或者测量最小限度残余ALL疾病，可以采用定量PCR的办法。此外，实时定量PCR已经用于量化染色体转位t(14;18)(q32;q21)[40,41]；卵泡淋巴瘤（FL）病人bcl-2基因的重组；或者干细胞治疗非霍奇金氏淋巴瘤的效果。这种办法也能够应用对普通人外周血液中bcl-2基因的重组从而作为判断这种背景重组水平怎样影响鉴定患有卵泡淋巴瘤（FL）的病人[43]。许多这类的研究都很大程度上受益于实时定量这种方法的应用。随着高度灵敏定量PCR实验手段的采用，将分子的反应关联作为临床诊断可能现在就实现了。
白血病DNA拷贝数的测量
DNA拷贝数的测量对于判定引发许多恶性肿瘤的染色体不平衡的程度是很重要的。有许多种办法测量肿瘤的DNA拷贝数；每种办法都有特定的优点和缺点。染色体组CGH能够探测整个染色体的不平衡性，但是分辨率很低。荧光原位杂交（FISH）对特异行为的细胞提供拷贝数的测量，但是原位杂交不能够大批量的完成而且也很难测量25拷贝数以上的DNA拷贝。PCR反应能够采用简单多重重复序列的重复来鉴定等位基因的不平衡。然而，如果这是一个PCR终止反应，定量的结论将会是错误的。
实时定量PCR已经用于鉴定等位基因的不平衡的许多研究之中[11,12,44,45]。在不同部位的特定基因或者标记DNA拷贝数的定量法列举了染色体不平衡的部位。在定义定量微卫星基因这种技术，一种白血病动物模型曾经用于定义老鼠的第二染色体上的普通的染色体缺失，这一条染色体类似于人类的白血病相关的染色体。将SJL品系的老鼠在电离射线的照射下暴露，染色体受到破坏，包括第二染色体也发生破坏，而且许多这样的老鼠都会患上白血病。这些缺失部位的基因对控制细胞的增值很可能有重要作用，并且这些基因的识别有助于阐明导致癌症发生的分子事件的模型体系，这些分子事件则是反过来着眼于与白血病病人相关的基因。因为这个区域非常大（～23cM），那么运用能够检测许多部位的方法QuMA能够有助于更进一步减少这些老鼠最小的普通缺失基因。
胞质分裂的表达分析
可信的细胞运动相关的mRNA定量表达轮廓对于分析特殊的免疫反应是很重要的[46]。准确的细胞运动水平的定量表达有助于检测免疫学反应。细胞运动在自体免疫，过敏反应，疾病传染又如炎症的引发和消炎反应[47]。另外，细胞运动一般着重于研究器官移植的抑制免疫力治疗方法。细胞运动在一些长期的发炎疾病中起着缓解作用，例如风湿性关节炎。与胞质分裂类似，不同细胞类型的化学增活现象和化学增活受体的表达水平对于更加深刻理解化学信号的运动过程是至关重要。定量PCR的使用已经很大程度地改善了细胞运动和化学信号在许许多多生物类论文中的地位。
设计稳定的实时定量PCR反应的标准
采用实时定量PCR做研究的最好方法取决于所要解决的科学问题。第一个区分点在于这项研究是否着眼于mRNA的表达水平（采用定量反转录PCR）或者DNA的拷贝数。其他的因素例如基因的数目，所覆盖的样品的数目都影响方法的选择。对于发射荧光信号，引物设计和鉴定，设计实时定量PCR反应的选择在下文介绍。
实验设计
有两种定量PCR的分析：“相对定量”和“标准曲线定量”。后者也被称为“完全定量”[49]；但是，这其实是用词不当。更准确的说法是标准曲线定量（五成或者十成连续稀释），就是以一条已知的标准曲线求得未知值。这种方法依赖于一些已知值，这就是它不可能为完全的原因。无论被鉴定的对象是什么，鉴定的方法多么仔细，还是没有办法知道在一个已知的样品到底有多少个拷贝。
相对定量是许多实时定量PCR研究的分析方法的一种选择。这种办法中，样品（DNA，cDNA）对照是指目的基因与一个调控基因实现的。定量的数值是将数值都对应地减去调控基因的循环基值，或者称为Ct，就是目的基因减去调控基因，因而循环之间的差值（ΔCt）为2（由于PCR反应的本质决定的），表明了这两个基因的模板的扩增倍数不同。与调控基因的比较存在着正值和负值。这种设想必须保证选中的调控基因在被研究的样品中拷贝数目和表达水平没有发生变化。如果这种设想能够成立，那么更多的样品能够在给定的托盘上或者多重托盘上进行实验这样就使得样品能够充分的相比较。将各种反应物适当地混合并且采用阳极移液枪头，这样就能够使每一个PCR管中各种模板的含量非常的相似。每个基因的每个样品三分之一的检测中的变化能够每个样品中基因含量的差别。
采用相对定量法要求所有基因PCR反应的效率要相似，并且最好大于或者等于90%。这能够通过将正控制模板10倍连续稀释，以模板浓度值的log[10]对数值绘制Ct曲线；曲线的斜率可以看作PCR反应的效率。斜率为-3.32表示PCR反应效率为100%（Fig.3）。相对于PCR效率100%的偏移值能够通过将斜率（S）代入下面的公式来求得： 。关于这方面的细节和其他的计算方法请看[11，12，50]。影响PCR反应效率变化的因素主要是MgCl2，引物，和探针的浓度。如果可以的话，最好维持一个稳定的退火温度，这样所有的PCR反应能够在同样的反应条件下进行。
图三 ：一个假设的标准曲线用于PCR效率和定量的计算。一般采用5倍稀释或者10倍稀释来绘制标准曲线。对于每一个输入的模板含量得到的Ct值可作为输入含量的Log[10]对数值的函数，得到直线能够符合数据。这样做能够优化PCR反应的效率并且能够对未知点进行定量（如图所示的灰色的点）。确定PCR反应的效率对于相对定量十分重要。得到符合数据的直线斜率可以通过图中的公式来计算PCR反应的效率。效率为100%的PCR反应斜率值为-3.32；该例子中效率为97%。确定该斜率的函数也能够用于计算未知样品的含量。大多数实时PCR仪都能够从一个标准曲线中依靠软件计算出未知样品中模板的含量。但是，也能够人工地将观测的Ct值代入公式：（observed Ct－y intercept）/slope。如果计算的PCR反应的效率大于100%，那么可能因为已知样品吸取值不准确，或者标准中有PCR抑制物。如果这种情况发生而又没有被发现（不能够执行PCR反应效率公式），在使用标准曲线定量方法时候，由于没有吸取准确或者没有同样的PCR反应的抑制物会造成对未知值计算值过高。
标准定量曲线法在少量或者大量的样品中测定小量基因或者计算滤过性病毒颗粒的数目时候能够成功的运用。使用这种方法没有必要做仔细地优化；但是最好采用高PCR反应效率的实验。并不是完全都需要一个调控基因，但是对未知物质的控制和加量小心地定量对于得到准确结果非常重要。加入一个调控基因有助于判断是否发生明显吸量错误。已知样品的标准曲线对于每一个托盘上的每一个基因是必要的，并且这个标准曲线能够正好横跨未知物质含量的上下。最普遍的已知样品来源即目的基因质粒，标准曲线是以起点含量的连续稀释而得到的，该起点含量可以通过分光光度计，荧光计，或者Pico Green（一种分子探针，Eugene，美国产）。如果没有质粒，还有另外一个选择能够更容易的获得标准曲线，就是对整个扩增元全部采用人工合成寡聚核苷酸。然而这种办法仅仅当扩增元小于100bp。但是，由于寡聚核苷酸的相对比较纯，在使用分光光度计定量时候能够较少的产生偏差。此外，标准值的准确测量和寡聚核苷酸物质的量的计算的可能性，都使得估计未知样品的拷贝数（不是确切的拷贝数目）成为可能。标准曲线最后一个选择是采用目的基因的拷贝数或者表达水平。未知样品可以从由三种来源产生的标准曲线容易地定量（图二）。
寡聚核苷酸的设计
Applied Biosystems中的Primer Express寡聚核苷酸设计软件可能是目前设计实时定量PCR反应所用寡聚核苷酸时候使用得最广泛的。能够设计出高效率反应的实验。Primer3是麻省理工大学设计的免费软件（见表一），这种软件也能够用于设计实时PCR反应，还包括设计插入内部的杂交探针。不考虑使用何种软件，最重要的就是实验的设计。如果采用SYBR Green I方法，PCR引物一定不能够形成一点点引物二聚体。每一个产物的熔点曲线可以用来保证荧光信号是最理想的PCR产物发生的。在mRNA表达实验中使用杂交探针，探针的序列应该包含外显子，可能的话包含外显子外延（图四）。并且，查阅基因组文库的扩增元序列能够保证实验的设计没有探测假基因。PCR产物的扩增元应该适当的小一些，杂交探针为70～150bp，STBR Green实验中采用小于300bp探针。
表一 有用的一些站点和链接：
设计用于mRNA表达水平检测的实时定量PCR实验
设计一个理想的实时定量PCR实验包含引物的选择，因为引物决定了扩增产物与
mRNA是相应的，并且不会扩增基因组DNA。如果采用SYBER-Green I染料，将会很麻烦但还是可以的。PCR引物其中的一个必需要包含内含子，这样引物3′端5～6个核苷酸能够与基因的外显子杂交，使得剩余部分能够与相临的外显子杂交。如图四A所示，这样的设计可以使污染的基因组DNA难以扩增。另一个更加典型的设计（如图四B），使用一个TaqMan探针或者一个分子标记，杂交探针跨越两个外显子的交接点，使它不能够识别基因组DNA。
核酸的纯化和cDNA的合成
在定量PCR反应中使用的核酸的纯度对于得到一个可以重复的结果是至关重要的。对于定量PCR实验最普遍的来源是细胞培养或者血液的产物。目前的可以使用的商业方法和试剂盒足以生成纯净的核酸样品。要注意的是在Chomczynski & Sacchi法中使用苯酚/氯仿混合溶液时候，任何一点点苯酚都会降低反转录的效率。此外，在使用紫外分光光度计定量时候，苯酚会造成样品中RNA测量得过多，因为苯酚也会吸收紫外光。其他的组织特异性污染物会造成反转录效率降低，甚至会非常低。
有许多篇关于从石蜡包埋的组织中抽取RNA用作实时定量PCR实验的报告；这种办法虽然很落伍，但还是实用的。然而，RNA的纯度对于获得好的数据是非常重要的。在这些研究中[22，23，52]，纯化RNA仍然耗费了大量的精力，例如利用K蛋白酶做三天的培养，尽量去除交联蛋白，尽管这种办法很落伍，这样得到的RNA非常纯。那些随即降解的RNA小片段对于实验没有坏的影响，因为实验中这些扩增元非常短。
对RNA样品中加入DNase酶进行处理是一部非常普通的步骤；但是，如果实验设计中杂交探针还会跨越外显子与外显子的交界处，那么就不需要这一步。如果实在没有其他的办法，在cDNA合成的前必需要经过DNase酶处理这一步，例如没有内含子的基因，目前最好的产品是Ambion公司的“DNA free”（Austin，TX，USA）。它能在溶液中进行DNA酶解而不需要进行热失活或者进一步的RNA沉淀。
实时定量PCR反应的另一个容易被人忽视的因素是反转录这一步。如果这一步不够仔细，会引入一些杂质，会阻碍正确地表达分析。不同的选择办法可以产生不同的cDNA：随机六聚体，寡聚核苷酸，或者运用许多种逆转录酶（RT）起始特异的基因。一般偏好的制备cDNA的方法是将整个RNA在MMLV逆转录酶作用下以随机引物起始而生成的。使用随机六聚体能够在制备cDNA时候产生最小偏差并且对相对定量法和绝对定量法有影响。此外，它同样也能够在后续的实验中检测其他基因，在运用相对定量法的时候也能够直接反映前一个研究对象的表达水平。在仅仅使用基因特异的引物或者寡聚核苷酸由RNA生成cDNA时候，可能会发生差异。特定序列的相互作用，如引物和RNA的发夹结构都可能使得某一些序列特异的引物比其他的引物更高的反转录效率。在使用标准曲线定量法对任何给定基因定量时候，这不是一个很明显的问题，但是在比较不同基因之间特别是使用相对定量法时候，这会是产生偏差的显著原因。然而，由于RNA的二级结构和poly A尾巴，使用寡聚胸腺嘧啶（oligo-dT）引物能够产生统计有偏的产物，这样也排除了在相对定量法中将18S 核糖体基因作为调控基因。扩增元距离poly A尾巴或者基因特异反转录酶起始位点的距离，在运用相对定量法中并且也只会在比较一个基因和另一个基因表达水平时候会产生错误。
两步法反转录PCR（RT－PCR）反应中，RT－PCR反应在一个独立于PCR反应以外的试管中进行。而一步法反转录PCR反应这两种反应在一个试管中进行。首先，两步法产生的cDNA能够运用于许多不用基因的不同实验，并且能够较少的对RNA进行操作，对RNA进行操作会造成降解。一步法的主要优势在于在同样的试管中运用两种不同“着色”的探针使得两个独立的PCR反应在一个多元反应系统中进行。这样能够保证两个反应都能够在确切的相同含量的cDNA下进行，然而这也可以通过将所有的反应组分除了引物和探针或者标记（后加）娴熟地混合来实现。一步法的第二个优势可能在于增加了实验的灵敏性，因为在同一个试管中反转录反应中所有的RNA也就是马上进行PCR反应的RNA。但是，一步法外加的一个复杂因素是在同一个环境中PCR反应和其他反应之间的相互作用和影响。如果一个基因比另一个基因有高得多的表达水平，PCR反应中由于高表达的基因能够抑制第二个PCR反应产生信号而造成试剂的局限性或者焦磷酸盐( 或酯)的聚集。此外，两个不同探针的光谱交叠会影响每个基因的定量。
图四：实时PCR反应典型基因引物A和杂交探针或者引物B的首选位置。该例上排是以基因组基团绘制的外显子（黑色矩形）和内含子（细线）；下排绘制了当“外显子－外显子”交界处转变成cDNA时候，mRNA变化过程。A图，设计的PCR引物（黑色箭头）跨越了基因组的一个内含子，引物3′端5～6个核苷酸补充临近的外显子。大片内含子的区域阻碍了引物对基因组DNA模板的聚合酶反应的起始。如果引物能够连接前后的cDNA，那么引物就能够起始PCR反应并且能够对cDNA提供特异性从而减少了污染的基因组DNA经PCR反应生成产物的机会。图B，类似的设计，图示的额外的双向探针或者分子标记跨越外显子与外显子之间的交叉点（小斑纹矩形和小斑纹圆圈代表荧光信号），因而对实时定量PCR反应提供了更多的特异性，因为荧光信号仅仅在引物起始cDNA模板才能产生。这是实时定量PCR反应的最佳设计，因为它简化了RNA的纯化过程因为它避免了DNase I处理这一步同样也减少了无效起始而产生的可识别信号，因为这在不使用杂交探针时候可能发生。
设计计算DNA拷贝数目的定量PCR反应
设计计算DNA拷贝数目或者滤过性病毒颗粒数目的定量PCR反应，一个好的实验设计较实时定量PCR 要考虑的因素少的多。扩增元要设计得要么在一个外显子中，要么包含在相对于基因组DNA特意的内含子的一部分。相对定量法和标准曲线定量法都可以使用。用于生成标准曲线的标准可以由实时定量PCR反应获得，但是相对定量法中内生调控基因的选择可以不同。出了使用两个拷贝数的已知基因，在微卫星标记侧面的引物的聚合体可以作为“调控基因”来减少非整倍样品中任何给定位点的过高过低估计，例如癌细胞。以固定的陈品和新鲜样品制备模板，DNA的纯度是首要的问题[50]。理想情况下，每一个DNA样品应该用过一个标准曲线确定是否存在任何PCR反应的抑制物，该抑制物会阻碍正确地定量。
定量PCR的局限
两种分析方法即相对定量法和标准曲线定量法都有明显的缺陷和潜在的不足。在使用标准曲线定量法时候，每一个基因都需要一个标准曲线，而这个标准曲线在96孔的托盘上会占据很多的空间。但是，使用384孔的AB7900型PCR仪，这就不是问题了。标准曲线的绘制需要质粒,寡聚核苷酸和其它源料，这无疑是额外的要求并且会造成差别，使得不同托盘上的数据难以比较。额外的托盘控制能够减少这种差别，但是它也会减少在每个托盘上可以进行实验的样品数目。此外，用于产生标准曲线的样品会发生变化并且使得那些数据没有规格划到标准细胞水平的实验室的数据难以比较。使用标准曲线法，在反转录这一步额外源料会造成错误，因为不同的RNA样品有着不同的反转录效率。虽然有这些缺点，标准曲线法仍然是一种有用的办法。对于一个小型的实验，它能够很快的准备并且进行实验而不需要很多额外实验优化，虽然PCR反应效率要求合适地计划和尽可能地优化。当然，这并不是依赖于内生调控基因不受实验条件影响的假说。
当有许多样品进行多种基因的鉴定时候，最好采用相对定量法。通常，每一个待测样品仅需要一个系列的孔(一般是三个一组)，这样能够在一个托盘上最大限度地进行样品鉴定。虽然相对定量法依赖于内生调控基因不受实验条件影响的假说，但是如果这种影响是很明显的话也是可以测定的。这能够通过对含有多个备选的内生调控基因的许多待测样品定量来实现。通过起始模板的仔细定量（使用RiboGreen I 或者PicoGreen，分子探针，Eugene公司，USA），并且使用被证实为线性的反转录方法，那么就可能确定在既定实验条件下的样品中任何可能的调控基因被作为有效地内生控制时是否充分一致。虽然这仅仅是一个近似值，它应该还可以对这些明显受到实验条件影响的备选调控基因进行定义。调控基因已经成功地应用于β-葡(萄)糖苷酸酶，GAPDH，18S rRNA，组蛋白 3.3a，泛醌等等的定量。
实时定量PCR反应的展望
既然实时定量PCR已经成为了科学研究的主流，那么这项技术的前景应用是非常令人兴奋的。最受关注的是将实时PCR与高级微型解剖技术，或者石蜡包埋储存样品的核酸，或者少量细胞完全转录扩增相结合。对难以分离的微量特异类型细胞测量基因表达水平或者DNA拷贝数目是可行的。定量PCR其他喜人的发展将会出现在实时技术应用于临床案例分析有助于临床医生对病人分层对待。最小限度残余疾病的识别和分析，滤过性毒菌的装载都将继续是研究的重要渠道。此外，细胞衍生的生物分子安全性的确定和类似逆转录病毒颗粒定量的地位会随着实时定量PCR反应而增强。其他的应用有助于鉴别治疗用重组mAbs生产时产生的潜在污染。将胚胎细胞或者母体循环的DNA分类技术与定量PCR技术结合能够让天生畸形的产前诊断使用最低限度的应对措施。实时PCR技术的应用能够继续进行基因芯片挑选基因的表达水平的确认。使用MGB探针，特异等位基因的表达分析还有极为特殊的生化武器证据甄别都成为可能。
