用于检测细胞基因转录水平的实时定量PCR 的操作流程

（Real Time Quantitative PCR Protocol For Detection of Gene Expression）

第一部分 原理
real time PCR 是普通PCR 的一项改进，使用了针对扩增DNA 的荧光物质，使得DNA的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到DNA 的扩增曲线（如，图一）。

图一：引自美国应用生物系统中国公司网站——实时荧光定量PCR ——一种科学准确的定量方法。

名词解释：
Rn:一个反应管经n 次热循环后，测得的荧光强度。
Rn+:反应管含有模板DNA。
Rn-:反应管含有模板DNA。
无模板对照：No template control，Rn-，理想情况下，是一条平线，只具有背景荧光数值。
Threshold: 荧光（Rn）超过本底时的临界数值。
Ct: threshold cycle，临界循环数，threshold 横线与扩增曲线相交，所得交点所对应的循环数。
基线：baseline, 是背景曲线的一段，范围——从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所有反应管的荧光都将要，但是还未，超出背景。
仪器：热循环仪器（GeneAmp Thermal Cycler 9600）+电脑（装有Sequence Detection System软件）+荧光检测系统(GeneAmp Sequence Detector 5700)（如，图二）。

全部实验包括步骤：
1，类似普通PCR 反应的物品混合于反应管，之外还要添加荧光物质（SYBR 染料 或 TaqMan探针）。
2，使用SDS 软件标明热循环仪器中放入的所有反应管，设定热循环仪器的温度变化，存储热循环仪器的工作情况，存储荧光信号，分析DNA 的扩增曲线。
3，利用SDS 输出的数据，其他专业数据处理软件，近似计算得到原始DNA 的浓度，做必要的误差分析。
SYBR 是一种结合于所有dsDNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。
TaqMan 探针是由产荧光基团，荧光淬灭基团，与扩增子有互补的核苷酸序列组成。

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