【求助】目的基因转录和表达水平改变的检测
丁香园论坛
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请问各位战友，小弟现在想做关于某个基因缺失后引起的基因转录和表达方面改变的研究，我只知道：
1.研究基因转录水平改变是检测其mRNA，最常用的是RT-PCR及荧光RT-PCR等方法,请问这方面有什么注意事项没有呢？
2.检测其蛋白质:用的最多的应该是Western Blot吧...但是因为我的标本只有患者的血液，假如真的存在因为基因缺失造成的相应功能蛋白表达改变（如降低等），不知道血液中的蛋白量的检测该如何做呢？我问过几个做生化的博士，他们都说WB适合做组织和细胞内的蛋白表达而不适合做血液（理由是血液中其他蛋白众多，会干扰）。如果有好的检测方法，注意事项是什么呢？
3.蛋白功能检测:有战友说如果表达的蛋白质有什么表型功能如酶等的可以用底物进行检测，是这样的吗？
恳请各位战友不吝赐教！小弟先谢过大家了！！！
1.研究基因转录水平改变是检测其mRNA，最常用的是RT-PCR及荧光RT-PCR等方法,请问这方面有什么注意事项没有呢？
2.检测其蛋白质:用的最多的应该是Western Blot吧...但是因为我的标本只有患者的血液，假如真的存在因为基因缺失造成的相应功能蛋白表达改变（如降低等），不知道血液中的蛋白量的检测该如何做呢？我问过几个做生化的博士，他们都说WB适合做组织和细胞内的蛋白表达而不适合做血液（理由是血液中其他蛋白众多，会干扰）。如果有好的检测方法，注意事项是什么呢？
3.蛋白功能检测:有战友说如果表达的蛋白质有什么表型功能如酶等的可以用底物进行检测，是这样的吗？
恳请各位战友不吝赐教！小弟先谢过大家了！！！
1、如果用PCR方法检测mRNA的表达状况，需要首先对PCR进行validation，包括重复性、灵敏度、文献使用的情况等进行分析。
2、体液标本中的蛋白检测，用ELISA可能更比较合适。
3、蛋白功能检测，如果该蛋白具有“酶”的表型功能，那么检测其催化作用，那么是最具有说服力的了。只要是已经报道过的蛋白，大部分都有其功能研究。择其广泛认可的功能进行检测即可。
如果你对我的解答感到满意，请留意一下置顶的这个帖子： http://www.dxy.cn/bbs/user/survey?id=420
也希望你能帮助解答别人的问题，谢谢。
2、体液标本中的蛋白检测，用ELISA可能更比较合适。
3、蛋白功能检测，如果该蛋白具有“酶”的表型功能，那么检测其催化作用，那么是最具有说服力的了。只要是已经报道过的蛋白，大部分都有其功能研究。择其广泛认可的功能进行检测即可。
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也希望你能帮助解答别人的问题，谢谢。
谢谢freecell战友。我也查过不少资料，在蛋白“定量”方面ELISA优于WB。但是我想知道的是，我需要比较发生某基因缺失患者体内所表达的相应蛋白和正常人之间在“量”上的差异，是不是同时用ELISA检测患者和正常对照血清中的相关蛋白含量呢？这样直接比较有可比性吗？
还有2个问题：
1.假如这个致病基因所表达的蛋白不是存在于血清中而是存在于细胞膜上或者细胞内，这时候好像ELISA就不适用了吧？我怎样对正常-患者的蛋白表达量进行比较呢？有的战友说可以做流式细胞检测，但是我对这个技术没有详细的了解，如果这个技术路线可行的话，能大致讲讲在我这个病例中的应用吗？
2.假如我这个致病基因所表达的蛋白在血液中不存在，而是像某些功能蛋白存在于组织或组织间隙中（例如诸多起信号转导作用的蛋白或存在于神经突触间隙等位置的突触信号传递蛋白），这些蛋白的表达量的检测又是用什么方法呢？
先谢谢freecell战友和大家了！！！
还有2个问题：
1.假如这个致病基因所表达的蛋白不是存在于血清中而是存在于细胞膜上或者细胞内，这时候好像ELISA就不适用了吧？我怎样对正常-患者的蛋白表达量进行比较呢？有的战友说可以做流式细胞检测，但是我对这个技术没有详细的了解，如果这个技术路线可行的话，能大致讲讲在我这个病例中的应用吗？
2.假如我这个致病基因所表达的蛋白在血液中不存在，而是像某些功能蛋白存在于组织或组织间隙中（例如诸多起信号转导作用的蛋白或存在于神经突触间隙等位置的突触信号传递蛋白），这些蛋白的表达量的检测又是用什么方法呢？
先谢谢freecell战友和大家了！！！
有战友帮忙解答一下吗？
我举得你可以先做一些标本的免疫组化，然后观察目的蛋白质的分布情况。如果水平变化比较大的话，还是可以有一个明显的趋势的；另外如果mRNA水平差异很大，也可以做ISH进行检测比较。
一旦决定了分布情况，可以根据情况分别检测：如果是细胞内或者细胞膜上面可以用流式细胞仪进行检测（观察Intensity）；另外不管在什么部位都可以用WB进行检测的。
一旦决定了分布情况，可以根据情况分别检测：如果是细胞内或者细胞膜上面可以用流式细胞仪进行检测（观察Intensity）；另外不管在什么部位都可以用WB进行检测的。
shmicy2001 wrote:
谢谢freecell战友。我也查过不少资料，在蛋白“定量”方面ELISA优于WB。但是我想知道的是，我需要比较发生某基因缺失患者体内所表达的相应蛋白和正常人之间在“量”上的差异，是不是同时用ELISA检测患者和正常对照血清中的相关蛋白含量呢？这样直接比较有可比性吗？
还有2个问题：
1.假如这个致病基因所表达的蛋白不是存在于血清中而是存在于细胞膜上或者细胞内，这时候好像ELISA就不适用了吧？我怎样对正常-患者的蛋白表达量进行比较呢？有的战友说可以做流式细胞检测，但是我对这个技术没有详细的了解，如果这个技术路线可行的话，能大致讲讲在我这个病例中的应用吗？
2.假如我这个致病基因所表达的蛋白在血液中不存在，而是像某些功能蛋白存在于组织或组织间隙中（例如诸多起信号转导作用的蛋白或存在于神经突触间隙等位置的突触信号传递蛋白），这些蛋白的表达量的检测又是用什么方法呢？
先谢谢freecell战友和大家了！！！
1。如果是胞膜蛋白可以利用流式检测，前提是有相应的流式检测抗体，并且表达的差异较大，而且作为细胞蛋白定量的方法western是金标准，除了一些常见的胞膜蛋白，即使你使用流式检测了，做好再用western验证一下，或者说至少在预实验时要验证一下，当然血液循环中的某些蛋蛋白，就像freecell版主说的，如果有盒子的话，还是ELISA比较简单。
2。对于你说的所谓的间隙蛋白，其实客观上来说大多数信号转到相关的蛋白是存在于细胞内的，很少有滞留于组织间隙中的信号蛋白，要么存在于循环中，要么结合于细胞上或者细胞内，某些组织蛋白可能浓度会，这是因为相应的具有较高亲和力的受体表达于组织细胞上；如果确实有这样的所谓的组织间隙蛋白，那么就是取相应的组织匀浆后western。
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