冰雪霜花
用小鼠的bend3细胞造模,内参用的actin,跑qpcr的时候发现随着ogd时间的延长,内参和目的基因的ct呈现等比例增加。比如内参在不造模,造模2h,5h和8h的时候,ct分别是14,15,17和21,而目的基因在这四组分别是24,25,28和32,最后Delta CT并没有发生改变,但是都增加了。请问有人知道应该怎么处理吗?
rna浓度同等程度稀释下,对照组可以到1700ng/ul,造模8小时只有180,随着造模时间的增加浓度也下降,但是rna的od都是在1.8-2.0之间,cDNA浓度都是300左右,od在1.77-1.83之间。qpcr每个基因的熔解曲线都非常漂亮整齐且稳定,只有ct很不正常。
汤姆卜丽波
没碰到过这种的。你的样本都是冻在-80的吧,是不是有降解,再跑一遍,然后根据内参调整一下逆转录比例
冰雪霜花
没有的,我是提了RNA之后立刻逆转录然后跑pcr,逆转录和pcr冰上进行,提取rna常温,整个过程不超过5h。
Eason老歌迷
内参一般都是恒定表达,很少有变化的,是不是随着时间延长,你的样本发生变化了。而且ct值如果超过35就不太准了。
whilt-shirt
有可能是随着时间的延长,部分细胞死掉了,导致部分RNA降解了
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