同源重组的引物退火温度该如何计算

退火温度＝4×（G＋C）＋2×（A＋T）－（5～知8） 只是粗算，有时不灵，但比道较简便。或者用primer5（or oligo6）计算，引物配对好后，primer5可以显示Tm，我认为这个值就是退火温度，我的经验再加2 or 3度最好。你的合成引物的单回子上也有个Tm，减去5～8也可。

看你第三轮overlap的区域是哪里，就用哪里计算退火温度