怎样选择内参蛋白？

内参就是内部参照，一般是指管家基因编码表达的蛋白，它们在各个组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照参。内参则可以校正蛋白质定量、上样过程中存在的误差，保证实验结果的准确性。

此外，内参可以作为空白对照，还可以检测蛋白转膜情况是否完全、整个 WB 显色发光体系是否正常。内参抗体种类很多，比如 β-Actin、β-Tubulin、GAPDH 等，下面简单介绍下如何选择内参。

一、目的蛋白分子量

选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差 5KDa 以上。比如检测目的蛋白分子量为 45KDa，此时不适宜选择 β-actin（42KDa）作为内参，可以考虑选择 GAPDH（36KDa）作为内参。

二、种属

不同种属的样本内参蛋白不同。

如哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择 β-actin、β-tubulin、GAPDH；植物来源实验样本，则可以选择 Plant actin、Rubisco等。

三、定位

不同表达部位内参蛋白不同

四、样品前处理（常常被忽略的内参选择因素）

内参的选择还需要考虑实际的实验环境和样品的前处理。在某些特殊条件下，一些内参蛋白的表达也不是绝对稳定的，会发生变化，也就是我们常说的，内参不齐。

下面我们来看下不同内参的适用环境：

【Actin】肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin 大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，其余两种广泛分布于各种组织中，包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin 广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富，其含量占所有细胞总蛋白的 50%。但是在一些少量特殊的情况下，如脂肪组织，β-actin的表达量就很少，此时 β-Actin 就不再适用于这些样本的内参。

【Tubulin】微管蛋白，是细胞的一种骨架蛋白。Tubulin 分为 α、β、γ、δ、ε等多种 tubulin，其中 α-Tubulin 和 β-Tubulin 可以形成异源二聚体，是形成微管的最主要的两种 Tubulin。α-tubulin 和β-tubulin 分子量分别为 55kDa 和 50kDa，其实际检测条带均在 55kDa 左右。作为内参，β-tubulin 的蛋白水平通常不会发生改变，因此被广泛用于 WB 时上样量是否一致的参照，也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。

【GAPDH】甘油醛-3-磷酸脱氢酶，是参与糖酵解的一种关键酶，催化糖酵解的第六步,它还参与核转录等事件,核糖核酸转录、DNA复制和修复以及细胞凋亡。由 4 个30-40kDa 的亚基组成，分子量 146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH 基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作WB的内参。在某些生理因素，如缺氧和糖尿病，会增加 GAPDH 在特定的细胞和组织的表达，如出现这类的样品，尽量避免选择 GAPDH 作为内参。

五、注意事项

1.内参的选择要根据具体的样本情况选择，没有一种内参能适用所有的组织和细胞样本。

2.内参蛋白应不受实验处理的影响，建议根据文献选择在特定细胞、特定状态下较稳定的内参；或者是同时做多个内参条带，再行选择。

3.上样前需要进行 BCA 实验测定蛋白浓度，以保持上样量一致。