【心得】东胜创新技术部对我所疑惑的几个定量PCR问题的回复
丁香园论坛
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1．我做的重复样品的标准曲线差别很大，这是什么原因？是不是CDNA样品不纯？
答复：如果操作正确的话，重复样本是不应该差别很大的。做重复样本时，应当将所有的反应成分都先混合到同一反应管当中，然后再进行分装。这样可以最大限度地降低加样误差和样品混合不匀的问题。您可以尝试一下，如果还有问题的话，可以把结果文件直接MAIL给我们。以便我们可以更直观地了解问题。
2．做realtime pcr的CDNA的浓度是多少？我看到有的文章说是需要先把CDNA稀释到1.25-5ng/ul,是这样吗？
答复：没有固定的浓度。与您的耙基因丰度有关系。如果丰度低自然就要多一些，如果丰度高，就可以少一下。一般来说都在ng/ul数量级。
3.对每个基因来说，是不是标准曲线只需要用特异引物做一次，模板用什么样的cDNA都可以？用同一模板不同时间作的标准曲线重复性应该是非常好的？
答复：制作标准曲线最好用带有耙基因片段的质(推荐)或纯化后的PCR产物作模板。不同的cDNA因提取过程中的差异和杂质含量的不同，公导致比较大的差异。如果模板条件无变化，不同时间制作的标准曲线应当是均一的，但要排除试剂的干扰。
4.我设置的反应程序是
1 94°C 30s，
2 94°C 10s，58°C 25s，72°C 30s，
3 Plate Read
4. Goto Line 2 for40 Times more
5 72°C 5min
6 Perform Melting Curve from 70 °C to 95°C；
read every 0.3°C;
Hold for 00:00:01 between reads.
END
我正在做的有六个基因，设计的引物通过从基因组中扩增检查都具有良好的特异性，扩增的片断大小从
80-160bp，我上面的程序用来做real-time rt-pcr可以吗？
答复：如果片段长度仅在80-160bp间的话，延伸时间没必要用到30秒，只需要15-20秒左右即可。这样有利于降低丰特异性扩增。另外，看反应程序您使用的应该是SYBR GREEN，如果是这样的话，您的片段长度有些偏短，可能会在一定程度上影响到实验效果。可以将片段长度增加到200bp左右，最适合的长度是250左右，不宜超过500。
5.为什么有的程序有一步
Plate read
incubate at 82°C for 00:00:01
也就是
1 94°C 30s，
2 94°C 10s，58°C 25s，72°C 30s，
3 Plate read
4 incubate at 82°C for 00:00:01
5 Plate Read
6. Goto Line 2 for40 Times more
7 72°C 5min
8 Perform Melting Curve from 70 °C to 95°C；
read every 0.3°C;
Hold for 00:00:01 between reads.
END
这一步是干什么用的？
有的还有在预变性之前有一部50几度的退火温度？这步程序有必要吗？
答复：82℃读板是为了消除可能存在的引物二聚体对实验的干扰。因为一般来说引物二聚体的TM值在80℃左右，产物的TM值多在85℃以上，这样如果是在72℃读板的话，得到的荧光值包括了引物二聚体和产物的结果。而在82℃读板，则可以消除引物二聚体的影响(此时多处于解链状态。所以对结果影响不大)。但此82℃不是一定的，可以通过融解曲线进行确定引物二聚体的峰和产物峰，然后挑选一个合适的读板值。
6.
RNA提取后用DNASE I处理纯化是不是必须的？得到cDNA后还需要用RnaseH处理吗？
答复：最好可以处理，但不是必须的，主要看您的提取效果。得到cDNA后无需处理
答复：如果操作正确的话，重复样本是不应该差别很大的。做重复样本时，应当将所有的反应成分都先混合到同一反应管当中，然后再进行分装。这样可以最大限度地降低加样误差和样品混合不匀的问题。您可以尝试一下，如果还有问题的话，可以把结果文件直接MAIL给我们。以便我们可以更直观地了解问题。
2．做realtime pcr的CDNA的浓度是多少？我看到有的文章说是需要先把CDNA稀释到1.25-5ng/ul,是这样吗？
答复：没有固定的浓度。与您的耙基因丰度有关系。如果丰度低自然就要多一些，如果丰度高，就可以少一下。一般来说都在ng/ul数量级。
3.对每个基因来说，是不是标准曲线只需要用特异引物做一次，模板用什么样的cDNA都可以？用同一模板不同时间作的标准曲线重复性应该是非常好的？
答复：制作标准曲线最好用带有耙基因片段的质(推荐)或纯化后的PCR产物作模板。不同的cDNA因提取过程中的差异和杂质含量的不同，公导致比较大的差异。如果模板条件无变化，不同时间制作的标准曲线应当是均一的，但要排除试剂的干扰。
4.我设置的反应程序是
1 94°C 30s，
2 94°C 10s，58°C 25s，72°C 30s，
3 Plate Read
4. Goto Line 2 for40 Times more
5 72°C 5min
6 Perform Melting Curve from 70 °C to 95°C；
read every 0.3°C;
Hold for 00:00:01 between reads.
END
我正在做的有六个基因，设计的引物通过从基因组中扩增检查都具有良好的特异性，扩增的片断大小从
80-160bp，我上面的程序用来做real-time rt-pcr可以吗？
答复：如果片段长度仅在80-160bp间的话，延伸时间没必要用到30秒，只需要15-20秒左右即可。这样有利于降低丰特异性扩增。另外，看反应程序您使用的应该是SYBR GREEN，如果是这样的话，您的片段长度有些偏短，可能会在一定程度上影响到实验效果。可以将片段长度增加到200bp左右，最适合的长度是250左右，不宜超过500。
5.为什么有的程序有一步
Plate read
incubate at 82°C for 00:00:01
也就是
1 94°C 30s，
2 94°C 10s，58°C 25s，72°C 30s，
3 Plate read
4 incubate at 82°C for 00:00:01
5 Plate Read
6. Goto Line 2 for40 Times more
7 72°C 5min
8 Perform Melting Curve from 70 °C to 95°C；
read every 0.3°C;
Hold for 00:00:01 between reads.
END
这一步是干什么用的？
有的还有在预变性之前有一部50几度的退火温度？这步程序有必要吗？
答复：82℃读板是为了消除可能存在的引物二聚体对实验的干扰。因为一般来说引物二聚体的TM值在80℃左右，产物的TM值多在85℃以上，这样如果是在72℃读板的话，得到的荧光值包括了引物二聚体和产物的结果。而在82℃读板，则可以消除引物二聚体的影响(此时多处于解链状态。所以对结果影响不大)。但此82℃不是一定的，可以通过融解曲线进行确定引物二聚体的峰和产物峰，然后挑选一个合适的读板值。
6.
RNA提取后用DNASE I处理纯化是不是必须的？得到cDNA后还需要用RnaseH处理吗？
答复：最好可以处理，但不是必须的，主要看您的提取效果。得到cDNA后无需处理
