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【心得】东胜创新技术部对我所疑惑的几个定量PCR问题的回复

丁香园

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1.我做的重复样品的标准曲线差别很大,这是什么原因?是不是CDNA样品不纯?

答复:如果操作正确的话,重复样本是不应该差别很大的。做重复样本时,应当将所有的反应成分都先混合到同一反应管当中,然后再进行分装。这样可以最大限度地降低加样误差和样品混合不匀的问题。您可以尝试一下,如果还有问题的话,可以把结果文件直接MAIL给我们。以便我们可以更直观地了解问题。



2.做realtime pcr的CDNA的浓度是多少?我看到有的文章说是需要先把CDNA稀释到1.25-5ng/ul,是这样吗?

答复:没有固定的浓度。与您的耙基因丰度有关系。如果丰度低自然就要多一些,如果丰度高,就可以少一下。一般来说都在ng/ul数量级。



3.对每个基因来说,是不是标准曲线只需要用特异引物做一次,模板用什么样的cDNA都可以?用同一模板不同时间作的标准曲线重复性应该是非常好的?

答复:制作标准曲线最好用带有耙基因片段的质(推荐)或纯化后的PCR产物作模板。不同的cDNA因提取过程中的差异和杂质含量的不同,公导致比较大的差异。如果模板条件无变化,不同时间制作的标准曲线应当是均一的,但要排除试剂的干扰。



4.我设置的反应程序是

1 94°C 30s,

2 94°C 10s,58°C 25s,72°C 30s,

3 Plate Read

4. Goto Line 2 for40 Times more

5 72°C 5min

6 Perform Melting Curve from 70 °C to 95°C;

read every 0.3°C;

Hold for 00:00:01 between reads.

END

我正在做的有六个基因,设计的引物通过从基因组中扩增检查都具有良好的特异性,扩增的片断大小从

80-160bp,我上面的程序用来做real-time rt-pcr可以吗?

答复:如果片段长度仅在80-160bp间的话,延伸时间没必要用到30秒,只需要15-20秒左右即可。这样有利于降低丰特异性扩增。另外,看反应程序您使用的应该是SYBR GREEN,如果是这样的话,您的片段长度有些偏短,可能会在一定程度上影响到实验效果。可以将片段长度增加到200bp左右,最适合的长度是250左右,不宜超过500。



5.为什么有的程序有一步

Plate read

incubate at 82°C for 00:00:01

也就是

1 94°C 30s,

2 94°C 10s,58°C 25s,72°C 30s,

3 Plate read

4 incubate at 82°C for 00:00:01

5 Plate Read

6. Goto Line 2 for40 Times more

7 72°C 5min

8 Perform Melting Curve from 70 °C to 95°C;

read every 0.3°C;

Hold for 00:00:01 between reads.

END

这一步是干什么用的?

有的还有在预变性之前有一部50几度的退火温度?这步程序有必要吗?

答复:82℃读板是为了消除可能存在的引物二聚体对实验的干扰。因为一般来说引物二聚体的TM值在80℃左右,产物的TM值多在85℃以上,这样如果是在72℃读板的话,得到的荧光值包括了引物二聚体和产物的结果。而在82℃读板,则可以消除引物二聚体的影响(此时多处于解链状态。所以对结果影响不大)。但此82℃不是一定的,可以通过融解曲线进行确定引物二聚体的峰和产物峰,然后挑选一个合适的读板值。



6.

RNA提取后用DNASE I处理纯化是不是必须的?得到cDNA后还需要用RnaseH处理吗?

答复:最好可以处理,但不是必须的,主要看您的提取效果。得到cDNA后无需处理
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