【分享】大家都来说说自己用的MSP引物序列吧
丁香园论坛
1569
有关甲基化引物的帖子版内已经很多了，但是同一种基因有多种引物，各引物的反应条件又多有差别，开此帖的目的一半是为了私心，想让大家帮我看看结果，出出主意，另外也是为了增进大家的交流，减少像我这种新手在摸索过程中所走的弯路。
先抛砖引玉一下，自己最近做p16.PTEN和MGMT三种基因的MSP：
p16
甲基化引物
上游为5′- TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC -3′，
下游为5′- GACCCCGAACCGCGACCGTAA -3′；
product size 150bp
非甲基化引物
上游为5′- TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3′
下游为5′- CAACCCCAAACCACAACCATAA -3′
product size 151bp
参考文献：Herman J G, Graff J R, Myohanen S, et al. Methylation-specific PCR: A novel PCR assay formethylation status of CpG islands.Proc NatlAcad Sci USA, 1996, 93: 9821 - 9826.
这对引物感觉还可以，毕竟是经典文献。不过小弟在最近几轮摸索过程中发现甲基化引物容易在500~750bp之间产生非特异条带，不知什么原因。此贴见于http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=11675649&sty=1&tpg=1&age=0
MGMT
甲基化引物
上游为5′-TTCGACG TTCGTAGGTTTTCGC-3′
下游为5′- GCACTCT TCCGAAAA CGAAACG-3′
product size 80bp
非甲基化引物
上游为5′- TTTGTG TTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3′
下游为5′- AACTCCA CACTC TTCCAAAAACAAAACA-3′
product size 94bp
参考：Tae Jun Park, Sang-Uk Han, Yong-Kwan Cho,et al. Methylation of O6-
Methylguanine-DNA Methyltransferase Gene Is Associated Significantly with K-ras Mutation, Lymph Node Invasion, Tumor Staging, and Disease Free Survival in Patients with Gastric Carcinoma.Cancer,2001;92(11):2760–2768.
这对引物由于目标片段都比较小，不容易和引物二聚体鉴别开来，但是引用的还是蛮多。
PTEN
甲基化引物
上游为5′- GGTTTCGGAGGTCGTCGGC-3′，
下游为5′- CAACCGAATAATAACTACTACGACG-3′
product size 155bp
非甲基化引物上游为5′- TGGGTTTTGGAGGTTGTTGGT-3′
下游为5′- ACTTAACTCTAAACCACAACCA-3′
product size 173bp
参考：Michele A. Zysman,William B. Chapman,and Bharati Bapatl. Considerations When Analyzing the Methylation Status of PTEN Tumor Suppressor Gene. American Journal of Pathology,2002,160(3):795–800.
这对引物至今没有P出目标条带，我的反应体系
25ul
dd水14.845ul，
buffer2.5ul，
dNTP2.5ul，
上下游引物各0.5ul，
TaKARa hotstart酶0.125ul，
修饰后的模板4ul。
反应条件：
95度10min，94度30s，56（非甲基化引物为52）度30s，循环40。72度1min，循环结束后72度再延10min，4度保存。
大家看看我的设置有没有问题，可以怎么改进？
看图：lane1为marker，lane2，4，6，8为甲基化引物MSP产物，lane3，5，7，9为非甲基化引物MSP产物，lane10和11为空白对照。
欢迎拍砖！
先抛砖引玉一下，自己最近做p16.PTEN和MGMT三种基因的MSP：
p16
甲基化引物
上游为5′- TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC -3′，
下游为5′- GACCCCGAACCGCGACCGTAA -3′；
product size 150bp
非甲基化引物
上游为5′- TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3′
下游为5′- CAACCCCAAACCACAACCATAA -3′
product size 151bp
参考文献：Herman J G, Graff J R, Myohanen S, et al. Methylation-specific PCR: A novel PCR assay formethylation status of CpG islands.Proc NatlAcad Sci USA, 1996, 93: 9821 - 9826.
这对引物感觉还可以，毕竟是经典文献。不过小弟在最近几轮摸索过程中发现甲基化引物容易在500~750bp之间产生非特异条带，不知什么原因。此贴见于http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=11675649&sty=1&tpg=1&age=0
MGMT
甲基化引物
上游为5′-TTCGACG TTCGTAGGTTTTCGC-3′
下游为5′- GCACTCT TCCGAAAA CGAAACG-3′
product size 80bp
非甲基化引物
上游为5′- TTTGTG TTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3′
下游为5′- AACTCCA CACTC TTCCAAAAACAAAACA-3′
product size 94bp
参考：Tae Jun Park, Sang-Uk Han, Yong-Kwan Cho,et al. Methylation of O6-
Methylguanine-DNA Methyltransferase Gene Is Associated Significantly with K-ras Mutation, Lymph Node Invasion, Tumor Staging, and Disease Free Survival in Patients with Gastric Carcinoma.Cancer,2001;92(11):2760–2768.
这对引物由于目标片段都比较小，不容易和引物二聚体鉴别开来，但是引用的还是蛮多。
PTEN
甲基化引物
上游为5′- GGTTTCGGAGGTCGTCGGC-3′，
下游为5′- CAACCGAATAATAACTACTACGACG-3′
product size 155bp
非甲基化引物上游为5′- TGGGTTTTGGAGGTTGTTGGT-3′
下游为5′- ACTTAACTCTAAACCACAACCA-3′
product size 173bp
参考：Michele A. Zysman,William B. Chapman,and Bharati Bapatl. Considerations When Analyzing the Methylation Status of PTEN Tumor Suppressor Gene. American Journal of Pathology,2002,160(3):795–800.
这对引物至今没有P出目标条带，我的反应体系
25ul
dd水14.845ul，
buffer2.5ul，
dNTP2.5ul，
上下游引物各0.5ul，
TaKARa hotstart酶0.125ul，
修饰后的模板4ul。
反应条件：
95度10min，94度30s，56（非甲基化引物为52）度30s，循环40。72度1min，循环结束后72度再延10min，4度保存。
大家看看我的设置有没有问题，可以怎么改进？
看图：lane1为marker，lane2，4，6，8为甲基化引物MSP产物，lane3，5，7，9为非甲基化引物MSP产物，lane10和11为空白对照。
欢迎拍砖！
