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【分享】大家都来说说自己用的MSP引物序列吧

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有关甲基化引物的帖子版内已经很多了,但是同一种基因有多种引物,各引物的反应条件又多有差别,开此帖的目的一半是为了私心,想让大家帮我看看结果,出出主意,另外也是为了增进大家的交流,减少像我这种新手在摸索过程中所走的弯路。
先抛砖引玉一下,自己最近做p16.PTEN和MGMT三种基因的MSP:
p16
甲基化引物
上游为5′- TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC -3′,
下游为5′- GACCCCGAACCGCGACCGTAA -3′;
product size 150bp
非甲基化引物
上游为5′- TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3′
下游为5′- CAACCCCAAACCACAACCATAA -3′
product size 151bp
参考文献:Herman J G, Graff J R, Myohanen S, et al. Methylation-specific PCR: A novel PCR assay formethylation status of CpG islands.Proc NatlAcad Sci USA, 1996, 93: 9821 - 9826.

这对引物感觉还可以,毕竟是经典文献。不过小弟在最近几轮摸索过程中发现甲基化引物容易在500~750bp之间产生非特异条带,不知什么原因。此贴见于http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=11675649&sty=1&tpg=1&age=0

MGMT
甲基化引物
上游为5′-TTCGACG TTCGTAGGTTTTCGC-3′
下游为5′- GCACTCT TCCGAAAA CGAAACG-3′
product size 80bp
非甲基化引物
上游为5′- TTTGTG TTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3′
下游为5′- AACTCCA CACTC TTCCAAAAACAAAACA-3′
product size 94bp
参考:Tae Jun Park, Sang-Uk Han, Yong-Kwan Cho,et al. Methylation of O6-
Methylguanine-DNA Methyltransferase Gene Is Associated Significantly with K-ras Mutation, Lymph Node Invasion, Tumor Staging, and Disease Free Survival in Patients with Gastric Carcinoma.Cancer,2001;92(11):2760–2768.

这对引物由于目标片段都比较小,不容易和引物二聚体鉴别开来,但是引用的还是蛮多。

PTEN
甲基化引物
上游为5′- GGTTTCGGAGGTCGTCGGC-3′,
下游为5′- CAACCGAATAATAACTACTACGACG-3′
product size 155bp
非甲基化引物上游为5′- TGGGTTTTGGAGGTTGTTGGT-3′
下游为5′- ACTTAACTCTAAACCACAACCA-3′
product size 173bp
参考:Michele A. Zysman,William B. Chapman,and Bharati Bapatl. Considerations When Analyzing the Methylation Status of PTEN Tumor Suppressor Gene. American Journal of Pathology,2002,160(3):795–800.

这对引物至今没有P出目标条带,我的反应体系
25ul
dd水14.845ul,
buffer2.5ul,
dNTP2.5ul,
上下游引物各0.5ul,
TaKARa hotstart酶0.125ul,
修饰后的模板4ul。
反应条件:
95度10min,94度30s,56(非甲基化引物为52)度30s,循环40。72度1min,循环结束后72度再延10min,4度保存。
大家看看我的设置有没有问题,可以怎么改进?
看图:lane1为marker,lane2,4,6,8为甲基化引物MSP产物,lane3,5,7,9为非甲基化引物MSP产物,lane10和11为空白对照。
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