【原创】western荧光淬灭的解决办法

不记得是07还是08年我发过一个帖子，询问western淬灭的解决办法，至今，仍有站有私信我关于这个问题的解决办法。与其一个一个的回复，还是发个帖子，特别说明，帮助更多的朋友走出这个困扰。

从私信我的站友的数量上看，western淬灭的现象还是挺普遍的。解决的办法其实非常简单，也常常有人提及，只是我们对这个改进有时不敢相信，或者没有做到相应的程度。呵呵，不卖关子了，下面就对荧光淬灭的现象形成和解决办法做一个详细的解答。

我们可以搜索站内的帖子，应该有不少都有提到，淬灭是由于显色反应中的hrp酶量过多造成的，推荐的改进方法是，减少hrp的量，包括，减少蛋白的上样量，降低一抗浓度，降低二抗浓度这三个方法，总之就是减少hrp在膜上的结合量。可能有的人会问，我大量的抗体或者蛋白上样量都做不出来，减少反而能做出来，这怎么可能呢？呵呵，其实我们首先要弄清楚，在显色反应中谁是过量的问题，当然是底物，因为，亮度与hrp的量相关，hrp与目的蛋白的量相关，只有底物过量hrp的量才能清楚的反应目的蛋白的量（这里就不考虑定性实验了）。因此，hrp相对于底物必须是不足量的。其次，应该有很多站友都遇到过这样一个现象：就是曝光时，条带特别亮，可是压上一两次片子，条带就灭了，但是如果把这张膜再用TBST洗过夜，再去曝光，荧光反而能持续更长的时间，这就是由于洗涤，使原先一些结合不牢的二抗掉了下来，曝光时，hrp的量降低了，不会较快的消耗底物，所以，发光的时间就变长了。

了解了这个淬灭原理，我们再来说说如果避免淬灭，影响淬灭的原因有很多，我们来一一说明：
1.一抗：抗体本身的特异性决定了实验好不好做，有的时候好的抗体，比如内参抗体，不需要很多的技巧，就能做出很好的结果。如果遇到特异性不好的抗体，非特异的结合会造成背景很强，留在膜上的hrp很多，所以也会引起淬灭，而抗体本来特异性就差，如果再减少蛋白上样量那就更做不出来了，所以，这种情况没有什么办法，就是多洗，增加洗涤的次数，我在实验室里，经常洗10遍20遍，不要担心洗会影响特异的结合，特意的抗原抗体反应，用洗瓶使劲冲都下不来，不特意的就会在冲洗的过程中，掉下来。
2. 转膜：与一抗特异性差类似的现象就是出现在转膜的过程中，就是转膜条件不合适造成的膜上蛋白量降低，有时候这种情况即使较好的抗体也会出现淬灭的现象，所以非常重要的是根据蛋白的大小选择gel的浓度，根据gel的浓度和蛋白的大小选择转膜的条件，可以适当的摸索一下转膜的条件，保证目的蛋白在膜上有较多的量。
3. 二抗：二抗即使是国产的也能有较好的效果，以前我们实验室用的最差的二抗是中杉金桥买一抗时赠送的二抗，出现过淬灭的问题，当时是担心抗体不好，所以都是1：:1000左右稀释，就淬灭的特别厉害，底片一压上去就灭了，后来把二抗浓度降到1:10000到1:20000，效果非常好都没有出现过淬灭的现象了。

这个经验完全验证了我上面说的淬灭的原理，所以站友们，请相信我，降抗体浓度和孵育时间（特别是二抗）+使劲洗（可以适当增加tween-20的浓度），一定可以解决荧光淬灭的问题。还有就是不同的一抗都有不同的脾气秉性，做得多了，也就能慢慢的就能感受到自己的问题出现在哪里，适时的调整抗体的孵育条件，一定可以做出很漂亮的带的。