【原创】膜蛋白抽提方法推荐
丁香园论坛
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哺乳动物跨膜蛋白承担各种生物功能，在疾病的发生、发展过程中扮演重要角色。膜蛋白的蛋白质组学分析是被大家看好的辨识新的药物靶标和/或疾病的生物学标记的好方法，并已得到广泛应用。然而膜蛋白通过许多疏水氨基酸残基锚定在膜结构里面，很难溶解在水性缓冲液系统中。为了制备膜蛋白样品，传统的方法是采用“去污剂＋机械处理”的操作方法获取膜蛋白，用于增溶的去污剂有离子型（如SDS）和非离子型的（如Triton?-X）等，前者会使多数蛋白完全变性，限制很多下游分析，而后者虽然相对温和，但抽提膜蛋白（特别是有多个跨膜区的膜蛋白）的效果往往很差。下面推荐的是两个公司的相关产品，也算是具有代表性的两种方法：
1． 默克的跨膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract 跨膜蛋白抽提试剂盒（简称TM-PEK，货号71772-3）是一种基于化学而非去污剂方法的高产膜蛋白制备试剂盒。其简便的两步法操作可以高效地富集膜蛋白和膜关联蛋白。试剂盒包括两种试剂，TM-PEK试剂A和TM-PEK试剂B，分别用于制备抽提缓冲液2A和抽提缓冲液2B。使用者通过实验摸索，可以根据特定目的蛋白的特点从中灵活选择最适缓冲液。用ProteoExtract TM-PEK试剂抽提得到的蛋白适合用于常见的各种蛋白分析方法。从以下的报告中，列举了TM-PEK制备的跨膜蛋白和多次跨膜蛋白样品在免疫印迹、活性分析及2D电泳等方面的实例。为了验证ProteoExtract跨膜蛋白抽提试剂盒抽提多次跨膜蛋白的有效性，我们用免疫印迹比较了Frizzled-4，CELSR-3（cadherin-EGF-lag seven-pass receptor-3）和EGFR（表皮生长因子，只有一个跨膜区）的样本制备效果。Frizzled和CELSR是WNT/ PCP （平面细胞极性）通路的重要组成成分，而这个重要的通路则控制了组织的极性和细胞的迁移。Frizzled蛋白与GPCRs有远源关系，但是除开都具有7个跨膜区的结构外，它们的结构和功能存在很大差异（参见Huang 2004）。血浆膜定位Frizzled蛋白是Wnt分泌蛋白和其它多种配基的受体（参见Huang 2004，Planutis 2007）。在人体内，Frizzled-4与家族性渗出性玻璃体视网膜病变（familial exudative vitreoretinopathy）有关，这个疾病导致视网膜破坏及听力持续下降。CELSR-3和CELSR-2的功能是控制神经元接触位点的相互作用和神经突触的生长。CELSR-3抑制生长，而CELSR-2促进生长（参见Shima 2007）。关于CELSR-3的数据很有限，反映出要制备完整的CELSR-3非常困难。Western blot分析比较了Triton-X 100和新发明的TM-PEK试剂A的抽提效果，SDS抽提的作为目的蛋白大小的阳性对照。结果表明，对于仅具单跨膜区的EGFR，Triton- X 100和TM-PEK试剂A的抽提效率相同。Triton-X-100抽提Frizzled-4效果很差，相反，TM-PEK试剂A得到的Frizzled-4在western blot中获得了明显的信号。而TM-PEK试剂对CELSR-3的抽提效果非常令人惊喜，这种全长的358kD蛋白只有TM-PEK试剂A才能获得，而SDS或Triton X-100效果都使人失望。
2． Thermo旗下Pierce的膜蛋白分离试剂盒（货号89881）——该试剂盒首先采用biotin标记膜蛋白（该膜蛋白一般需要有暴露在膜外的赖氨酸残基和足够长度的膜外区段），然后利用偶联有中性亲和素的琼脂糖beads直接将膜蛋白沉淀下来，最后将膜蛋白洗脱。这是一个比较新颖的操作方法，很值得大家参考。
The kit efficiently labels proteins that have accessible lysine residues and sufficient extracellular exposure. The isolation procedure uses a cell-impermeable, cleavable biotinylation reagent (Sulfo-NHS-SS-Biotin) to label exposed primary amines of proteins on the surface of intact adherent or suspension cells. Treated cells are then harvested and lysed, and the labeled surface proteins are affinity-purified using Thermo Scientific NeutrAvidin Agarose Resin. The isolated cell surface proteins contain a small, nonreactive tag of the originally labeled primary amines but are no longer biotinylated (biotin remains bound to the resin). The kit contains sufficient reagents for eight experiments, each involving four T75 flasks of confluent cells.
References：
1.??Handlogten, M.E., et al. (2005) Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). Am J Physiol Renal Physiol.289, F347-F358.
2.??Ding, S., et al. (2005) Investigating the Putative Glycine Hinge in Shaker Potassium Channel. J. Gen. Physiol.126, 213-226.
1． 默克的跨膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract 跨膜蛋白抽提试剂盒（简称TM-PEK，货号71772-3）是一种基于化学而非去污剂方法的高产膜蛋白制备试剂盒。其简便的两步法操作可以高效地富集膜蛋白和膜关联蛋白。试剂盒包括两种试剂，TM-PEK试剂A和TM-PEK试剂B，分别用于制备抽提缓冲液2A和抽提缓冲液2B。使用者通过实验摸索，可以根据特定目的蛋白的特点从中灵活选择最适缓冲液。用ProteoExtract TM-PEK试剂抽提得到的蛋白适合用于常见的各种蛋白分析方法。从以下的报告中，列举了TM-PEK制备的跨膜蛋白和多次跨膜蛋白样品在免疫印迹、活性分析及2D电泳等方面的实例。为了验证ProteoExtract跨膜蛋白抽提试剂盒抽提多次跨膜蛋白的有效性，我们用免疫印迹比较了Frizzled-4，CELSR-3（cadherin-EGF-lag seven-pass receptor-3）和EGFR（表皮生长因子，只有一个跨膜区）的样本制备效果。Frizzled和CELSR是WNT/ PCP （平面细胞极性）通路的重要组成成分，而这个重要的通路则控制了组织的极性和细胞的迁移。Frizzled蛋白与GPCRs有远源关系，但是除开都具有7个跨膜区的结构外，它们的结构和功能存在很大差异（参见Huang 2004）。血浆膜定位Frizzled蛋白是Wnt分泌蛋白和其它多种配基的受体（参见Huang 2004，Planutis 2007）。在人体内，Frizzled-4与家族性渗出性玻璃体视网膜病变（familial exudative vitreoretinopathy）有关，这个疾病导致视网膜破坏及听力持续下降。CELSR-3和CELSR-2的功能是控制神经元接触位点的相互作用和神经突触的生长。CELSR-3抑制生长，而CELSR-2促进生长（参见Shima 2007）。关于CELSR-3的数据很有限，反映出要制备完整的CELSR-3非常困难。Western blot分析比较了Triton-X 100和新发明的TM-PEK试剂A的抽提效果，SDS抽提的作为目的蛋白大小的阳性对照。结果表明，对于仅具单跨膜区的EGFR，Triton- X 100和TM-PEK试剂A的抽提效率相同。Triton-X-100抽提Frizzled-4效果很差，相反，TM-PEK试剂A得到的Frizzled-4在western blot中获得了明显的信号。而TM-PEK试剂对CELSR-3的抽提效果非常令人惊喜，这种全长的358kD蛋白只有TM-PEK试剂A才能获得，而SDS或Triton X-100效果都使人失望。
2． Thermo旗下Pierce的膜蛋白分离试剂盒（货号89881）——该试剂盒首先采用biotin标记膜蛋白（该膜蛋白一般需要有暴露在膜外的赖氨酸残基和足够长度的膜外区段），然后利用偶联有中性亲和素的琼脂糖beads直接将膜蛋白沉淀下来，最后将膜蛋白洗脱。这是一个比较新颖的操作方法，很值得大家参考。
The kit efficiently labels proteins that have accessible lysine residues and sufficient extracellular exposure. The isolation procedure uses a cell-impermeable, cleavable biotinylation reagent (Sulfo-NHS-SS-Biotin) to label exposed primary amines of proteins on the surface of intact adherent or suspension cells. Treated cells are then harvested and lysed, and the labeled surface proteins are affinity-purified using Thermo Scientific NeutrAvidin Agarose Resin. The isolated cell surface proteins contain a small, nonreactive tag of the originally labeled primary amines but are no longer biotinylated (biotin remains bound to the resin). The kit contains sufficient reagents for eight experiments, each involving four T75 flasks of confluent cells.
References：
1.??Handlogten, M.E., et al. (2005) Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). Am J Physiol Renal Physiol.289, F347-F358.
2.??Ding, S., et al. (2005) Investigating the Putative Glycine Hinge in Shaker Potassium Channel. J. Gen. Physiol.126, 213-226.
