酵母基因组的抽提方法

问：我电转化的酵母抽基因组后做PCR鉴定，本就有颜色筛选的，应该成功率很大的啊，可是我鉴定了无数个克隆，就是拉不出PCR来。难道抽基因组的方法很关键吗？有的文献甚至用菌落做PCR，是不是骗人的啊？

我是用蜗牛酶（鼎国）破壁，再冻融几次，然后用SDS做用一会后加入蛋白酶K，数小时后酚氯仿作用，离心取上清后沉淀DNA，溶解后加RNA作用后，再酚氯仿抽提一次。不知是否有问题？谁有好的方法？

答：如果做地是短片断PCR（小于1.5kb）,用菌落PCR完全可以，而且在筛选时可省去许多时间，用抽基因组做PCR鉴定，太耗时了。我给你一个做菌落PCR的protocol，我是用这种方法做的，很好用！具体方法：

①take cells from a fresh plate (it doesn't work as well if the plate comes out of the fridge)

②with a small tip resuspend a little bit of a yeast colony (not the whole colony) in 25 µl PCR mastermix

③run PCR with the following parameters:

1、 95 °C, 5 min

2.、95 °C, 30 sec.

3、50-55 °C, 30 sec.

4、72 °C, 1min/kb

5、72 °C, 3 min

run 35 cycles (steps 2 to 4)

④load the whole reaction on agarose gel