RNA抽提方法

一、准备工作

1、实验器具与材料：

（1）移液枪：1ml、200ul、10ul

（2）吸头：1ml、200ul、20ul

（3）吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个

（4）EP管1.5ml、100ul

（5）玻璃研磨器

（6）容量瓶：1000ml

（7）盐水瓶：100ml

（8）15ml塑料管一个（配75%乙醇用）

2、实验器具的处理与准备

（1）塑料制品：（包括吸头、EP管等）

将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。

（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）

先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次。

（3）金属制品：（镊子等）

先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）

3、试剂配制和准备：

（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。配75%乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压。

（2）75%乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水：无水乙醇=1：3），然后放于-20℃备用。

（3）异丙醇：放入棕色瓶

（4）氯仿：放入棕色瓶

（5）Trizol：100ml/瓶存放于4℃

二、抽提时注意事项：

全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。

三、抽提步骤

1、匀浆化作用

取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下，室温静置5分钟。

2、分离阶段

每1mlTrizol中加0。2ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室温静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。

3、RNA的沉淀

将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-500ul），加入0.5ml异丙醇，混匀后放于-20℃中1小时，后12000rmp离心10分钟。

4、RNA的洗脱小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。

5、RNA的再溶解

小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约30分钟，此时RNA沉淀变透明）。注意不能让RNA沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分钟助溶。

6、RNA的保存

提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录。