【交流】阳性克隆筛选方法汇总——基于ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9基因敲除方法
丁香园论坛
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<font>阳性克隆筛选方法汇总</font></center>
——基于ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9基因敲除方法
近几年来，基因重组的技术层出不穷，包括TALEN和CRISPR/Cas9在内的重组技术给基础研究提供更为方便和快捷的分子生物学工具。
关于这些技术的具体原理和操作细节，这里不做展开介绍，主要谈一谈在用这些技术进行细胞株构建的过程中，如何做才能加快阳性克隆筛选的步伐,做好这个关键的步骤。
一. 混合克隆pool验证
质粒转染后48-72小时后取转染后细胞的pool 1000个细胞以上离心，去上清，PBS洗一遍，细胞沉淀溶于适量的PBS中，煮5min后模板就制备好了，剩余的pool细胞做有限稀释，一般5块板足够。
分析敲除位点的上下游序列，设计合适的引物PCR扩增目的基因片段，与野生型目的基因杂交后CruiserTM酶切15-20分钟，酶切产物1.5%-2%凝胶电泳。
上图为混合克隆pool酶切检测，由此图可知此混合克隆pool中有敲除成功的细胞，则进行下一步并计算突变率。这一步尤为重要，很多杂志投稿时需要这张图，或者有计算突变率的要求。
二. 阳性克隆筛选
上一步采用有限稀释法接种到96孔板中的克隆，待到单个细胞长到几百到1000个细胞左右时，取出其中的一半细胞提取基因组。分析敲除位点的上下游序列， 设计合适的引物，并从提取的基因组中扩出目的片段，然后选择CruiserTM或者T7EI进行酶切分析，最后将酶切分析得到的阳性克隆再进行测序进行最终确认。 <center> <img src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/08/B1407489169_small.jpg" /></center> 此图为两个阳性克隆的酶切结果，先酶切再测序不仅可以避免单一方法出现的假阴性，而且可以满足大部分杂志会要求，以免被要求补数据。
为了可以很快的筛选到阳性克隆可以通过如下几个方式去进行优化：
1、 尽可能提高单细胞的存活率
a) 对于单个细胞很难存活的细胞，如果是贴壁细胞，可以试着加一些细胞因子促进细胞的分裂；而对于悬浮细胞，则推荐采用Cell Plaza（共培养的原理），都可以极大的提高细胞的存活率；
b) 对于很容易老化的细胞，推荐对细胞进行永生化改造，永生化的方法有很多，这里不做具体推荐。
2、 采用能够快速抽提微量样品基因组DNA的试剂盒
这样的试剂盒，市面上也比较多，但是需要注意选择针对样品量比较少的试剂盒，建议选择QIAGEN或者Genloci的微量样品的抽提试剂盒。QIAGEN是老品牌，Genloci这家公司是主要做基因重组的，所以，他们开发的一些产品针对性比较强，而且价格便宜，建议优先使用。
3、 设计合理的引物和选用高保真的Taq酶
引物设计推荐选择靠近靶位点上游100bp和下游200bp处，或者上游200bp和下游100bp处，这样的好处是后面进行酶切分析的时候，对于阳性的克隆，可以很容易观察到2条分开的条带。
Taq酶，建议是用NEB的Fusion或者Q5，毕竟敲除本身很大可能也就是2-3个碱基的缺失，所以，高保证是必要的，防止产生假阳性的结果。
4、 选择高特异性的错配酶
目前用的比较多的是CEL I和T7E I 两种酶，CELI是植物来源的一种特异性识别碱基错配的酶，活性高，不会产生假阳性。目前市面上只有CruiserTM和Surveyor和两个品牌。其中Surveyor是进口代理产品， 价格较贵，货期较长；CruiserTM价格合适，同时货期短，国内可以2-3天内到货，做到真正质优价廉。
T7E I是NEB的产品，最早并不是为了做基因敲除筛选用的。其最主要的特点是除了识别错配外，还可以识别十字型结构DNA、Holliday 结构或交叉 DNA、异源双链 DNA，正是因为这个特点，很容易导致假阳性的现象。 <center> <img src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/08/A1407488887_small.jpg" /></center> <center> 图1. Holliday交叉（Holliday junction），无错配结构</center> 5、 选择服务好的测序公司
测序公司往往是比较容易忽略的一个环节，很多人送测序后，拿到的测序结果经常发现没信号，就认为是自己的样品有问题，而不会去怀疑测序公司。实际上是错误的思维方式，测序是苦力活，人员流动比较大，所以经常会发现某一段时间的测序结果总是不好，实际上跟样品无关而跟测序公司的人员流动有很大关系。所以，一定要找一些资质比较好的测序公司，同时，发现问题的时，可以考虑换一家公司再测一遍。
近几年来，基因重组的技术层出不穷，包括TALEN和CRISPR/Cas9在内的重组技术给基础研究提供更为方便和快捷的分子生物学工具。
关于这些技术的具体原理和操作细节，这里不做展开介绍，主要谈一谈在用这些技术进行细胞株构建的过程中，如何做才能加快阳性克隆筛选的步伐,做好这个关键的步骤。
一. 混合克隆pool验证
质粒转染后48-72小时后取转染后细胞的pool 1000个细胞以上离心，去上清，PBS洗一遍，细胞沉淀溶于适量的PBS中，煮5min后模板就制备好了，剩余的pool细胞做有限稀释，一般5块板足够。
分析敲除位点的上下游序列，设计合适的引物PCR扩增目的基因片段，与野生型目的基因杂交后CruiserTM酶切15-20分钟，酶切产物1.5%-2%凝胶电泳。
上图为混合克隆pool酶切检测，由此图可知此混合克隆pool中有敲除成功的细胞，则进行下一步并计算突变率。这一步尤为重要，很多杂志投稿时需要这张图，或者有计算突变率的要求。
二. 阳性克隆筛选
上一步采用有限稀释法接种到96孔板中的克隆，待到单个细胞长到几百到1000个细胞左右时，取出其中的一半细胞提取基因组。分析敲除位点的上下游序列， 设计合适的引物，并从提取的基因组中扩出目的片段，然后选择CruiserTM或者T7EI进行酶切分析，最后将酶切分析得到的阳性克隆再进行测序进行最终确认。 <center> <img src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/08/B1407489169_small.jpg" /></center> 此图为两个阳性克隆的酶切结果，先酶切再测序不仅可以避免单一方法出现的假阴性，而且可以满足大部分杂志会要求，以免被要求补数据。
为了可以很快的筛选到阳性克隆可以通过如下几个方式去进行优化：
1、 尽可能提高单细胞的存活率
a) 对于单个细胞很难存活的细胞，如果是贴壁细胞，可以试着加一些细胞因子促进细胞的分裂；而对于悬浮细胞，则推荐采用Cell Plaza（共培养的原理），都可以极大的提高细胞的存活率；
b) 对于很容易老化的细胞，推荐对细胞进行永生化改造，永生化的方法有很多，这里不做具体推荐。
2、 采用能够快速抽提微量样品基因组DNA的试剂盒
这样的试剂盒，市面上也比较多，但是需要注意选择针对样品量比较少的试剂盒，建议选择QIAGEN或者Genloci的微量样品的抽提试剂盒。QIAGEN是老品牌，Genloci这家公司是主要做基因重组的，所以，他们开发的一些产品针对性比较强，而且价格便宜，建议优先使用。
3、 设计合理的引物和选用高保真的Taq酶
引物设计推荐选择靠近靶位点上游100bp和下游200bp处，或者上游200bp和下游100bp处，这样的好处是后面进行酶切分析的时候，对于阳性的克隆，可以很容易观察到2条分开的条带。
Taq酶，建议是用NEB的Fusion或者Q5，毕竟敲除本身很大可能也就是2-3个碱基的缺失，所以，高保证是必要的，防止产生假阳性的结果。
4、 选择高特异性的错配酶
目前用的比较多的是CEL I和T7E I 两种酶，CELI是植物来源的一种特异性识别碱基错配的酶，活性高，不会产生假阳性。目前市面上只有CruiserTM和Surveyor和两个品牌。其中Surveyor是进口代理产品， 价格较贵，货期较长；CruiserTM价格合适，同时货期短，国内可以2-3天内到货，做到真正质优价廉。
T7E I是NEB的产品，最早并不是为了做基因敲除筛选用的。其最主要的特点是除了识别错配外，还可以识别十字型结构DNA、Holliday 结构或交叉 DNA、异源双链 DNA，正是因为这个特点，很容易导致假阳性的现象。 <center> <img src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/08/A1407488887_small.jpg" /></center> <center> 图1. Holliday交叉（Holliday junction），无错配结构</center> 5、 选择服务好的测序公司
测序公司往往是比较容易忽略的一个环节，很多人送测序后，拿到的测序结果经常发现没信号，就认为是自己的样品有问题，而不会去怀疑测序公司。实际上是错误的思维方式，测序是苦力活，人员流动比较大，所以经常会发现某一段时间的测序结果总是不好，实际上跟样品无关而跟测序公司的人员流动有很大关系。所以，一定要找一些资质比较好的测序公司，同时，发现问题的时，可以考虑换一家公司再测一遍。
