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    材料与仪器

    步骤

    利用模块装配方法构建 ZFN

    材料

    试剂

    琼脂糖凝胶（2.5%)

    牛小肠碱性磷酸酯酶

    d N T P (每种10 mmol/L )

    转化用大肠杆菌

    MgCl2 (50mmol/L )

    质粒： pBluescript (p B S --Z F ) 和 p c D N A 6 (Invitrogen)

    P C R 片段纯化试剂盒

    10 X 聚合酶缓冲液

    限制性内切核酸酶： A p a l 、 B a m H I 和 SpeI

    T 7 引物

    T a g 聚合酶

    Zif-ZFN D N A 模板

    仪器

    37℃加热块或者水浴

    按预期的扩增程序工作的循环变温加热器
    指 1 片段 IOfiI 指 2 片段 10卩 1 指 3 片段 IOfil 10 X 聚合酶缓冲液 5^1 M g C l 2 (50m m o l /L ) 2/j.l d N T P (每种 10m m o l /L ) 1^1 指 1 的共用引物 3Opmol 指 3 的特异引物 3Opmol T a g 聚合酶 2U 加水至终体积50M l 循环参数：见上述扩增各个单指的P C R 步骤。 5 . 用 P C R 片段纯化试剂盒纯化P C R 产物。 6 . 用 B a m H I 和 S 扣I 对 P C R 产物进行酶切。 7•用2. 5 % 琼脂糖凝胶纯化酶切片段。片段的预期大小约为312bP。 8 . 将酶切/纯化的P C R 片段克隆人经B a m H I /S 和I 酶切的pBluescript (Pbs-Z F )。 9•测序验证新三指蛋白。 从新三指蛋白中获得一个ZFN 10•用B a w z H I M ^ a I 酶 切 p c D N A 6 (37°C ， 2h 后，室 温 2h )。加入牛小肠碱性磷酸醋 酶，凝胶纯化分离5. I k b 的片段，得到的是载体片段。 11.用 S 扣I M a J 对 G F P l -Z F N 进 行 酶 切 （37°C 2h 后 ，室 温 2h ) ， 凝胶纯化分离约 591b p 的片段，得到的是F o H 核酸酶结构域（F n ) 片段。 12. 用 5_111/3扣 I 对 p B ^ Z F 克隆进行酶切，凝胶纯化分离约312b p 的片段，得到的 是三条蛋白片段。 13. 按标准程序，以载体： F n 片 段 ： Z F 片 段 1 : 4 : 4 的摩尔比连接这些片段。 14. 按标准程序，转化入K c 0K 。 15.B _ H I /A 如 I 酶切鉴定阳性克隆。 正确克隆应有一条5. I k b 的条带和一条909b p 左右的条带。 I6•用T7 引物进行测序，验证铸指的完整性以及锌指蛋白和核酸酶结构域之间的接& 在框架结构内。 该克隆方法得到的ZFN, 锌指末端组氨酸和核酸结构域第一个残基之间有5 个 氨 基 & 已发表的文献中，将 这 称 作 LO ZFN, 但在将来，可能将它称作L5 ZFN。

    来源：丁香实验

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