丁香实验_LOGO找产品，上丁香通
登录
提问
提问
我要登录
｜免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

材料与仪器

步骤

利用模块装配方法构建 ZFN

材料

试剂

琼脂糖凝胶（2.5%)

牛小肠碱性磷酸酯酶

d N T P (每种10 mmol/L )

转化用大肠杆菌

MgCl2 (50mmol/L )

质粒： pBluescript (p B S --Z F ) 和 p c D N A 6 (Invitrogen)

P C R 片段纯化试剂盒

10 X 聚合酶缓冲液

限制性内切核酸酶： A p a l 、 B a m H I 和 SpeI

T 7 引物

T a g 聚合酶

Zif-ZFN D N A 模板

仪器

37℃加热块或者水浴

按预期的扩增程序工作的循环变温加热器
指 1 片段 IOfiI 指 2 片段 10卩 1 指 3 片段 IOfil 10 X 聚合酶缓冲液 5^1 M g C l 2 (50m m o l /L ) 2/j.l d N T P (每种 10m m o l /L ) 1^1 指 1 的共用引物 3Opmol 指 3 的特异引物 3Opmol T a g 聚合酶 2U 加水至终体积50M l 循环参数：见上述扩增各个单指的P C R 步骤。 5 . 用 P C R 片段纯化试剂盒纯化P C R 产物。 6 . 用 B a m H I 和 S 扣I 对 P C R 产物进行酶切。 7•用2. 5 % 琼脂糖凝胶纯化酶切片段。片段的预期大小约为312bP。 8 . 将酶切/纯化的P C R 片段克隆人经B a m H I /S 和I 酶切的pBluescript (Pbs-Z F )。 9•测序验证新三指蛋白。 从新三指蛋白中获得一个ZFN 10•用B a w z H I M ^ a I 酶 切 p c D N A 6 (37°C ， 2h 后，室 温 2h )。加入牛小肠碱性磷酸醋 酶，凝胶纯化分离5. I k b 的片段，得到的是载体片段。 11.用 S 扣I M a J 对 G F P l -Z F N 进 行 酶 切 （37°C 2h 后 ，室 温 2h ) ， 凝胶纯化分离约 591b p 的片段，得到的是F o H 核酸酶结构域（F n ) 片段。 12. 用 5_111/3扣 I 对 p B ^ Z F 克隆进行酶切，凝胶纯化分离约312b p 的片段，得到的 是三条蛋白片段。 13. 按标准程序，以载体： F n 片 段 ： Z F 片 段 1 : 4 : 4 的摩尔比连接这些片段。 14. 按标准程序，转化入K c 0K 。 15.B _ H I /A 如 I 酶切鉴定阳性克隆。 正确克隆应有一条5. I k b 的条带和一条909b p 左右的条带。 I6•用T7 引物进行测序，验证铸指的完整性以及锌指蛋白和核酸酶结构域之间的接& 在框架结构内。 该克隆方法得到的ZFN, 锌指末端组氨酸和核酸结构域第一个残基之间有5 个 氨 基 & 已发表的文献中，将 这 称 作 LO ZFN, 但在将来，可能将它称作L5 ZFN。

来源：丁香实验

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序