利 用 GFP 报道系统测定新三指 ZFN

利 用 GFP 报道系统测定新三指 ZFN

材料

试剂

转化用大肠杆菌

F A C S 缓冲液

磷酸盐缓冲液（P B S )

2 % 小牛血清

1 mmol / L E D T A

0.1 % 叠氮化钠

G 4 1 8

H E K -293 细胞

M A C S 缓冲液

P B S

2 % 小牛血清

1 mmol / L E D T A

培养基

全 D M E M : D M E M / 1 0 % 牛 血 清（HycIone) /2mmol/L L-谷氨酰胺

无血清 D M E M

质粒

G F P 表达质粒

G F P 修 复 质 粒（R S 2700 质粒）

I-SceI 表达质粒

亲本报道质粒（P P C 17)

Zif-Z F N 表达质粒

限制性内切核酸酶： B a w H I 、 E c o R I、 Himilll、 SpeI 及 XAoI

靶位点寡聚核苷酸（见步骤 2)

仪器

电转化 仪（B T X E C M 399)

流式细胞仪

磁珠分选系统（Miltenyi, A u b u r n , California)

组织培养板（10 cm 和 24 孔）

方法

构建 G FP 报道质粒

1.用 XhoI 和 HfndIII 对亲本报道质粒（p P C 1 7 ) 进行酶切，通过凝胶纯化分离得到约9kb 大小的质粒。

2.合成靶位点寡聚核苷酸，其中一个半位点是 Zif-ZFN (―个活性已知的 Z F N ) 的结合位点，另一个半位点是新的靶位点。设计一对寡聚核苷酸，使其复性后，能够产生 XhoI 和 H h d I I I 的互补末端。在 Z F N 全位点的 5'引 入 E c o R I 位点，从而为鉴定插入寡聚核苷酸的克隆提供一个新的限制酶酶切位点。例如，为了测定具有 5'_G A G G T T G C T -3'靶位点的 H G B Z F 1-Z F N , 我们合成了以下序列的寡聚核苷酸：

A : 5'- A G C T G A A T T C C G C C C A C G C ggatcc G A G G T T G C T -3';

B : 5'-T C G A A G C A A C C T C ggatcc G C G T G G G C G G A A T T C -3'，

3.按标准程序，将 A 、 B 寡聚核苷酸复性，并连入纯化的报道质粒载体中，载 体 ：退火寡聚核苷酸的摩尔比为 1 : 100。

4.按标准程序，将连接产物转化人大肠杆菌中。

5.通过 E c o R I 酶切鉴定克隆。

连人寡聚核苷酸的克隆酶切后产生 MOObp、 2100bp、 1700b p 的片段，在 400b p 处有一个双联体。

6.用 A 220A 引 物（5'- A C C G G C A A G C T G C C C G T G C C C T G G -3') 对酶切后有正确片段的克隆进行测序，验证载体中插人单拷贝的寡聚核苷酸。

7.Midiprep 验证克隆后，制备一定质量和数量的 D N A , 按标准程序，构建报道细胞系。

构建 G F P 报道细胞系

由于 H E K -293 细胞容易生长和转染，因此我们在该细胞中构建报道细胞系。下面描述了我们利用电转化仪构建 293 G F P 基因靶向细胞系的方法。

8.在 I O c m 培养板上，用 全 D M E M 培 养 H E K -293 细 胞（不 是 对 G 4 1 8 已经耐受的H E K -293-T 细胞），使其长到对数生长期。

9•消化细胞，并 用 I O m l 无血清的 D M E M 洗一次。用无血清的 D M E M 重悬细胞，细胞密度为 10⁶ 个/m l 。

10.取 出 400ul 细胞，将它与 10 邱超螺旋的报道质粒混合。
我们发现，用该比例时，细胞系含有单拷贝的整合体。

11.将细胞在冰上孵育 5min ，接着在 B T X E C M 399 电转化仪上以 150V 进行电转化。

12.将细胞在冰上恢复 5min , 接着转移到预先加入10ml 全 D M E M 的 10 cm 培养板中。

13.第二天，加入 G 418，使其终浓度为 500ug/m l 开始筛选。

14.以该培养基培养细胞，每 3〜4 天换液一次，动作轻柔以免破坏正在形成的克隆。

15.G 418 筛选 2 周后，单个克隆都已经很明显。通过选择单克隆产生一个单克隆报道细胞系，并分析每个克隆细胞表面人 C D 8a (C D 8 ) 基因的表达情况。鉴定 出 C D 8在细胞表面具有稳定高表达的克隆，并作为报道细胞系。简单测定 Z F N 时 ，一个多克隆群体已经足够。以下步骤简要描述了如何产生一个多克隆群体。

16.在第 2 周 ，瞬时消化培养板上的细胞而不去除细胞表面的 C D 8。

17.用 10 ml M A C S 缓冲液洗涤消化下的细胞，接着用 100ul M A C S 缓冲液重悬。

18.用 M ilte n y i 的磁珠分选系统，利 用 CD8 微球纯化 CD8 + 细胞。

我们发现 G4 1 8 耐受克隆中有 3 0 % 〜5 0 % 的 CD8 + 。通 常 该 CD8 + G418 耐 受 的 多 克 隆 群 体（称为「Z FN 报道系」）足以定量测定新设计的 ZFN。

利用新的 G F P 报道细胞系通过磷酸钙转染测定新的 ZFN

说 转 染 前 一 天 ，将 Z F N 报道系按 10⁵/孔 用 全 D M E M 铺 在 2 4 孔培养板上。铺 12个孔。

20.转染前，将培养基替换成 500ul 全 D M E M 。

21.按磷酸钙转染步骤，将以下质粒转染每个孔。

孔 1: 200ng G F P 表达质粒+200 ng I-SceI 表达质粒

孔 2〜4 : 200ng G F P 修复供者质粒（R S 2700 质粒)+200 ng I-SceI 表达质粒

孔 5: 200ng G F P 表达质粒+ 100 n g G F P -Z F N l + 100 n g G F P -Z F N 2

孔 6〜8: 200n g G F P 修 复 供 者 质 粒（R S 27 0 0 质粒）+ 1 0 0 n g G F P - Z F N l + 100ngG F P -Z F N 2

孔 9: 200ng G F P 表达质粒+ I O O n g Zif-Z F N 表达质粒+ 100 n g 新 Z F N 表达质粒

孔 10〜12: 200ng G F P 修 复 供 者 质 粒（R S 2700 质粒）+ 100 n g Zif-Z F N 表达质粒+ 100 n g 新 Z F N 表达质粒

22.将磷酸钙/D N A 沉淀在细胞表面孵育 8〜16 h 。

23.去除培养基和沉淀，替换成 I m l 全 D M E M 。

24.转染后 66〜78 h ，瞬时消化细胞，并 用 1ml F A C S 缓冲液洗涤。重悬在 400m1F A C S缓冲液中。

25.用流式细胞仪分析细胞中 G F P 的表达情况。

26.用转染效率（从 孔 9 测得）校正实验条件下 G F P 阳性细胞的比率（孔 10〜12 的平均），从而测定基因靶向的比率。用 I-S c e I 的 靶 向 效 率（从 孔 1〜4 测得）或者用G F P -Z F N 的靶向效率（从 孔 5〜8 测得）校 正 Z F N 的靶向效率，将 新 Z F N 的活性与其他 Z F N 进行比较。在该系统中，没有双链断裂的靶向背景比率为百万分之一。