【求助】G蛋白偶联受体定位错误
丁香园论坛
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大家好。
最近在做建一个高表达某G蛋白偶联受体的CHO细胞株，载体是pEGFP-C1。
稳定筛选后，细胞的荧光表达很好。
但奇怪的问题是，该受体定位出现了问题。原本该定位在膜的G蛋白偶联受体，现在基本上呈全细胞分布，而且核尤其亮。百思不得其解。
请各位战友指点。
附图为该细胞的Confocal图，没有染核。
多谢大家啦！
最近在做建一个高表达某G蛋白偶联受体的CHO细胞株，载体是pEGFP-C1。
稳定筛选后，细胞的荧光表达很好。
但奇怪的问题是，该受体定位出现了问题。原本该定位在膜的G蛋白偶联受体，现在基本上呈全细胞分布，而且核尤其亮。百思不得其解。
请各位战友指点。
附图为该细胞的Confocal图，没有染核。
多谢大家啦！
呵呵，你的confocal照的效果很不好呀。不过确实可以看到其定位主要在核内。反而膜上基本看不到。
我觉得比较有可能的原因是G蛋白与GFP的组合改变了G蛋白的结构，从而影响G蛋白的胞内定位。
或者是PEGFP-C1质粒多克隆位点在GFP的下游，所以表达出来的GFP是在目的蛋白的N端，这有可能影响它的膜定位序列。可以试一下PEGFP-N1的载体，让GFP表达在目的蛋白的C端，可能会好一点。
我觉得比较有可能的原因是G蛋白与GFP的组合改变了G蛋白的结构，从而影响G蛋白的胞内定位。
或者是PEGFP-C1质粒多克隆位点在GFP的下游，所以表达出来的GFP是在目的蛋白的N端，这有可能影响它的膜定位序列。可以试一下PEGFP-N1的载体，让GFP表达在目的蛋白的C端，可能会好一点。
谢谢楼上的指点。
还是有个问题不太明白。
如果这个G蛋白定位错误了，为什么细胞没有发现把它降解呢，反而还让它继续存在，而且奇怪的是还能够入核。我的这个G蛋白分子量是44kd，也没有核定位序列，它怎么进去核的呢？
还是有个问题不太明白。
如果这个G蛋白定位错误了，为什么细胞没有发现把它降解呢，反而还让它继续存在，而且奇怪的是还能够入核。我的这个G蛋白分子量是44kd，也没有核定位序列，它怎么进去核的呢？
另外，有一篇国内文献报道，也是用EGFP-C1连的这个目的蛋白，也是转的CHO，就转成功了。不知道是不是我们的CHO有微小差别？还是概率事件呢？
rebeccagold wrote:
谢谢楼上的指点。
还是有个问题不太明白。
如果这个G蛋白定位错误了，为什么细胞没有发现把它降解呢，反而还让它继续存在，而且奇怪的是还能够入核。我的这个G蛋白分子量是44kd，也没有核定位序列，它怎么进去核的呢？
我记得有些蛋白进核并不需要NLS，而是由其他蛋白协同进去的。至于为什么没有降解，这个可能性就多了，我们过量表达的蛋白细胞也一样没能降解掉呀，细胞也忙不过来呀。
哈哈，谢谢楼上的建议。
我下周再最后试试功能实验，如果不行我就放弃它了。
我下周再最后试试功能实验，如果不行我就放弃它了。
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