【求助】研究一个基因的5‘非翻译区是否含有低氧转录因子的结合位点,请指教
丁香园论坛
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这里做基因调控区的前辈一定不少，希望能给点意见，我在研究一个基因的5‘非翻译区是否含有低氧转录因子的结合位点，前期的工作是通过软件分析该区域是否存在这个结合位点的疑似序列，然后将这疑似的序列构人到PGL-3sv40中，转染细胞，经过低氧处理（低氧转录因子会增加）检测双萤光素酶的表达变化。如果有，还可以通过突变碱基进一步确定，但是如果不存在这样的结合位点，那我构出来的这个调控区质粒，不知道还可以做点别的什么试验？
这个就真的很难说了！不过你把这段序列连上去的话也应该是一段不短的序列，所以你后面做的也就是研究一下转录调控了，看看还有没有其他的可能转录因子影响此蛋白的调控。再说了，构建一个质粒做个预实验不算是麻烦的事了吧，你好像有点苛刻自己了，做的东西都必须要有用的。呵呵！
可以用低氧转录因子的载体共转染，检测luciferase活性
其实是有生理效应的低氧处理效果应该更为广泛吧，因为低氧处理会引起机体广泛的应激以及相应的转录调控。低氧处理的话会使更多的低氧转录因子表达上调，如果在这种情况下，此基因（这里指检测的萤光素酶的活性）还不能变化，那么单一的转录因子又怎么会其更为重要的调控作用呢？
不过以上看法只是个人理论上的推测，还请更多的战友提出自己的看法与见解！
不过以上看法只是个人理论上的推测，还请更多的战友提出自己的看法与见解！
tthua123456 wrote:
可以用低氧转录因子的载体共转染，检测luciferase活性
谢谢两位的建议，其实我目前主要就是研究低氧转录因子1的，软件分析发现该基因的5’端含有这个转录因子的结合疑似序列，所以这个建议我觉得可行~~，不过我目前还是先通过物理和化学缺氧看是否能使得萤光素酶表达发生变化，下一步可以考虑做个共转染。
你可以先低氧处理细胞，用real time PCR或Western检测你的基因是否上调。如果真的上调，接下来再做荧光素酶分析，如果分析有变化，再做点突变，或EMSA，ChIP等。
如果real time PCR或Western没有变化，就没有必要接着往下做了，因为有些时候，荧光素酶分析有变化，real time PCR或Western不一定有变化。荧光素酶分析不完全等同于体内，毕竟是克隆出来的载体，一些染色体调控，如组蛋白等的调控，不同于体内。单单一个荧光素酶分析说明不了问题。
如果real time PCR或Western没有变化，就没有必要接着往下做了，因为有些时候，荧光素酶分析有变化，real time PCR或Western不一定有变化。荧光素酶分析不完全等同于体内，毕竟是克隆出来的载体，一些染色体调控，如组蛋白等的调控，不同于体内。单单一个荧光素酶分析说明不了问题。
zhao22840718 wrote:
你可以先低氧处理细胞，用real time PCR或Western检测你的基因是否上调。如果真的上调，接下来再做荧光素酶分析，如果分析有变化，再做点突变，或EMSA，ChIP等。
如果real time PCR或Western没有变化，就没有必要接着往下做了，因为有些时候，荧光素酶分析有变化，real time PCR或Western不一定有变化。荧光素酶分析不完全等同于体内，毕竟是克隆出来的载体，一些染色体调控，如组蛋白等的调控，不同于体内。单单一个荧光素酶分析说明不了问题。
应该说此实验在前期已经证实过低氧会引起该基因的变化吧，要不也不会随便找一段序列就做此基因调控吧？否则就是课题设计的问题了，呵呵！
可以用怀疑结合的区域序列设计probe，做EMSA的抗体竞争实验，验证一下是否有结合。
zhujoker wrote:
应该说此实验在前期已经证实过低氧会引起该基因的变化吧，要不也不会随便找一段序列就做此基因调控吧？否则就是课题设计的问题了，呵呵！
呵呵，有的时候是看文献，别人做的有变化，真正换到自己要做的细胞，就不一定有变化了。
学习中~~
luoqq1985 wrote:
这里做基因调控区的前辈一定不少，希望能给点意见，我在研究一个基因的5‘非翻译区是否含有低氧转录因子的结合位点，前期的工作是通过软件分析该区域是否存在这个结合位点的疑似序列，然后将这疑似的序列构人到PGL-3sv40中，转染细胞，经过低氧处理（低氧转录因子会增加）检测双萤光素酶的表达变化。如果有，还可以通过突变碱基进一步确定，但是如果不存在这样的结合位点，那我构出来的这个调控区质粒，不知道还可以做点别的什么试验？
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