细胞内示踪研究

细胞内示踪研究

材料

试剂

待金纳米颗粒处理的细胞

蒸馏去离子水 (d d H 20)

乙 醇（200 proof) ( 3 0 % 、5 0 % 、7 5 % 、8 5 % 、％ % _1_0_0_~7_~B~K~Hp~M~2~1~0~Kp~M~2~1~0~0明 胶（B 型，B l o o m strength 225)

戊二醛 (2. 5 % ，溶 于 0. lmol/L 甲次砷酸钠缓冲溶液)

甘 氨 酸（0. lmol/L )

醛 ( 4 0 % 戊二醛)

氯化金 (4.34% m /V )

培养基: 细胞生长培养基和无血清培养基

四氧化锇 (1% 溶 于 0. lmol/L 甲次砷酸钠缓冲溶液)

甲次砷酸钠缓冲溶液 (〇. lmol/L )

氢氧化钠 (〇.lmol/L )

S purr 树脂

柠檬酸钠 (1% m /V ，新鲜配制)

仪器

Aclar 板

铝片

37°C 细胞培养箱

冷冻干燥机

6 〇°C 烘箱

回流冷凝管

250m l 圆底烧瓶

6 孔组织培养板

透射电子显微镜

超速离心机

超薄切片机

37°C 水浴

方法

金纳米颗粒的制备

1.在连接回流冷凝装置的 250m l 圆底烧瓶中加人 99 ml d d H 20 。

2.加 入 230)lJ 4. 34%(»27 V ) 氣化金溶液，揽伴，加热到回流。

3.加人大约 2.-5m l 新鲜配制的 l% ( m /V ) 柠檬酸钠溶液。

4.加 热 IO m in，溶液的颜色由灰色变为黑紫色，葡萄酒色，最后深红色。

5.继续加热 2〜3m i n , 直到瑢液呈稳定的橘红色。

6 . 冷却反应液至室温，4°C 保存。

7.32 000r / m i n 离心分离金纳米颗粒。颗粒的粒径范围为 1 0 〜 1 5 n m 。

蛋白质纳米球包裹金纳米颗粒

8•将 200m g 明胶溶解在 20m l 水中，配 制 l% 〇 n /V ) 明胶溶液，在 37℃水浴下溶解。

9•将上述制备的金纳米颗粒和明胶溶液在 37°C 下混合。

10.用 O.l m o l / L N a O H 调节溶液 p H 至 7.0。接着，然后按方案 1 步骤 3〜5 制备明胶纳米颗粒。为了制备包裹金纳米颗粒的明胶颗粒，按方 案 1 描述的方法将它们分散在明胶溶液中。

11•离心分离包裹金的明胶纳米颗粒，按方案 1 步骤 6〜8 冻干。
细胞培养

1 2 •把 A d a r 板剪成方形，尺寸和 6 孔板匹配。
减去其中一个小角, 用于区分细胞生长面 (图 3)。

13.加人合适的培养基，在 A c l a r 板种植细胞， 37° C 培养到 5 0% 的细胞密度。细胞接种密度可以为 I X l O ⁵ 个每孔; 根据细胞生长的快慢，培 养 24〜48 h 。

14.将包裹金纳米颗粒的明胶纳米粒重悬于无血清的培养基，37°C 和细胞一起培养。

为了确定细胞对纳米颗粒的吞噬时间, 可调节培养时间为 1〜6 h , 不同时间点取样, 用电镜观测。

15•除去纳米颗粒悬浮液，加入培养基。

16.分时间点制样，按照下面操作制备电镜样品。

电镜样品的制备

17•取出样品浸入 2 ml 2. 5 % ( m A 〇的戊二醛中 I h(戊二醛溶于 0.lmol/L 甲次砷酸钠缓冲溶液)。

18.用 0 • lmol/L 甲次砷酸钠缓冲溶液 4 °C 下清洗样品 3 次 ，每 次 lO m in 。

19•用 1%（m/v）四氧化锇 (溶于 O.lm 〇 l/L 二甲砷酸盐缓冲溶液) 室温下固定细胞 l h ,然后用 0 • lmol/L 甲次砷酸钠缓冲溶液清洗 3 次 ，每 次 lOmin。

20.用不同浓度的乙醇依次浸泡细胞，进行脱水处理，乙醇浓度依次为 30%、5 0 % 、7 5 % 、8 5 % 和 95%, 每次浸泡 l O min。

2 1 •室温下用 1 0 0 % 乙醇脱水处理 lh。

22.用 I : 1 乙醇和 S p u r r 树脂浸润细胞 I.5 h , 接着用 100% Spurr 树脂包埋 2 h

23.将带有脱水和树脂包埋细胞的 A c l a r 板置于覆盖 S p u r r 树脂的铝片的底部，60°C 烘箱中加热聚合 24 h 。

2 4•超薄切片 S p u r r 树脂中的样品。