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材料与仪器

步骤

细胞转染和分析

材料

试剂

待转染细胞

异 丙 醇(70%)

培养基:合适的细胞生长培养基和无血清培养基

Mounting m e d i u m (biomeda)

磷酸盐缓冲生理盐水(P B S ; 无菌)

报道质粒 D N A (如 E G F P -I 、 C M V -( B)

台盼蓝

I X 胰蛋白酶- E D T A (0.05% 胰蛋白酶, 0. 53m m o l /L E D T A 溶磁)

仪器

流式细胞仪(F A C S )

荧光显微镜(如 O l y m p u s B X 61)

用于荧光显微镜观察的盖玻片
载玻片 37°C细胞培养箱(5 % CO2) 细胞计数板 6 孔组织培养板 方法________________________________________________________________ 细胞转染 1•把盖玻片在7 0 % 乙醇中浸泡几分钟。用镊子镊取盖玻片在酒精灯火焰上穿过消毒。 2 . 把消毒盖玻片放在6 孔培养板的底部。 3 . 用 I X 胰蛋白酶-EDTA消化细胞。 4 . 离心分离细胞,在新培养基中重悬。 5 . 在大约50W细胞液加人2(%1台盼蓝,对死细胞染色,并对活细胞计数。 6 . 在置有盖玻片的6 孔板每孔种植IO5 个细胞。 7. 37°C , 5 % CO2 气氛培养细胞至5 0 % 细胞密度。 8 . 将负载DNA或奕光标记的明胶纳米颗粒分散在无血清的培养基中,并加人到细胞 中,确保每孔中纳米颗粒含20MgDNA。 9. 将细胞培养6h ,吸除含有纳米颗粒的培养液,用无菌P B S 洗涤,换上新鲜培养基。 细胞转染分析 1〇•按如下方法分析细胞转染效率 荧光显微镜观察 a•在转染的不同时刻(至少培养6h ,才能观察到报道基因的表达),吸除培养基, 用无菌P B S 清 洗 3 次。 b. 将盖玻片固定到干净的载玻片上,使用不含突光杂质的固定液。 c. 用荧光显微镜观测细胞对纳米颗粒的吞噬和细胞内纳米颗粒的分布。 图 5 所示含无菌盖玻片的6 孔 板 。载 有 EGFP-N l 质 粒 D N A 的纳米粒子转染NIH-3T 3 细胞 的荧光照片如图6 (见彩版)所示 。 ' 图 5•用于荧光显微研究的6 孔培养板, ,含无菌盖玻片。在 6 孔板中的每孔放置无菌的盖玻片。
图 6 . 明胶纳米粒子包载p E G F P N l质 粒 DNA, 并 转 染 NIH-3T 3 细 胞 24h 后 ,用 OlympusBX6 1 观察的微分干涉显微照片(A ) 和 荧 光 显 微 照 片 (B)。 F A C S 分析 按步骤3〜9 培养并转染细胞,使用不含盖玻片的6 孔板,按如下方法操作: a. 培养足够时间以使细胞合成质粒D N A 编码的蛋白质。 b . 按照使用质粒D N A 的类型,定量分析转染效率。如使 用 E G F P 报道基因,可 用 F A C S 分 析 G F P 蛋白的表达。如果是萤光素酶,测量化学荧光,而卩-半乳糖 苷酶的表达则可用染色法观察。

来源:丁香实验

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