明胶纳米颗粒的制备和 D N A 装载

明胶纳米颗粒的制备和 D N A 装载

材料

试剂

乙醇 (200 proof)

明股 ( B 型, B l o o m strength 225)

甘氨酸 (0. lmol/L )

醛 ( 4 0 % 戊二醛)

磷酸盐缓冲液 (P B S )

配置 IL 的 PBS，在 9 〇〇ml的水中溶解 8 g 氯化钠、〇 • 2 g 氯化钾 ；1.44 g 磷酸氢二纳和 0 • 24 g 磷酸二氢钾，调节 ph 为 7.4, 最后将溶液总体积定容为 1L。

PicoGreen 或其他结合 D N A 的荧光染料

蛋白酶

氢氧化 ( N a O H 0. lmol/L )

仪器

冷冻干燥机

超速离心机

37°C 水浴

方法

明肢纳米颗粒的制备

1.将 200m g 明胶溶于 20m l 水中，37℃水浴中溶解, 制备 1% (W ) 明胶溶液。

2.用 0. l m o l / L N a O H 溶液调解明胶溶液的 p H 为 7.0。如要装载 D N A , 跳到步骤 9。

3.在剧烈搅拌下加人约 65m l 乙醇，直至溶液浑独。

为了获得较高的产率，应使温度和 PH 保持恒定。溶液浑浊但没有肉眼可见的颗粒表明纳米颗粒的形成。

4•将 0. I m l 的 40%(m/V ) 戊二醛溶液稀释至 l m l，持续搅拌下，在 10 min 内缓慢滴加到纳米颗粒中。这将使单个纳米颗粒交联，而避免两个以上纳米颗粒之间交联或聚集。

5•加入 I O m l 0 •lm o l/L 甘氨酸封闭过量的醛基。

分离和纯化

6.超速离心分离收集纳米颗粒 (16 000r/m i n ，30m i n )。

7•将沉积物重悬在水中, 重复离心，以除去微量的乙醇和未反应的甘氨酸。

8 . 反复清洗后，将纳米颗粒沉积物重悬在 I m l 或 2m l 水中冻干。

明胶纳米颗粒负载 DNA

9 . 明胶纳米颗粒负载 D N A 。

包 载 DNA

a. 在待制备纳米颗粒的明胶溶液中溶解质粒 D N A ,D N A 浓度为 0. l%（m/m）〜1 %( m/m )。

为了避免沉积现象, 在调节 p H 之 后 加 人 DNA, 这 样 可 以 确 保 D N A 是物理包裹在纳米明胶颗粒内的，而不是通过静电作用形成复合物或简单吸附在纳米颗粒表面。

b. 参 照 步 骤 3〜8 纯化包载 D N A 的明胶纳米颗粒。

制备表面吸附 DNA 的纳米颗粒

a. 制备空白的明胶纳米颗粒溶液，然后和药物/D N A 溶液培养。调解悬浮液 P H , 以使明胶纳米颗粒的表面带正电荷。

b. 同上分离纳米颗粒以除去残余的 D N A 。

包载或表面吸附 D N A 量的确定

10•用合适的方法绘制 D N A 溶液的标准曲线，使 用 P i c o G r e e n 或其他能结合双链 D N A的荧光染料。

11.离心分离负载 D N A 的纳米颗粒。

12.反复清洗除去纳米颗粒表面吸附的 D N A 。

13.收集上清液和清洗液，测量 D N A 的浓度。

14•用初始加入 D N A 总量减去上清液和清洗液中 D N A 的量，按下式计算装载效率。

装载效率（％ ) = 包裹量/总量 X 100

15.也可直接将负载 D N A 的明胶纳米颗粒用 0. 2m g /m l 蛋白酶的 P B S ( p H 7. 4) 溶液培养 30m i n 使纳米颗粒完全降解，生成澄清的溶液，然后用 P i c o G r e e n 或相似染料直接测量 D N A 的负载量