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WB的经验总结

丁香园

2648

1.根据厂家说明安装玻璃板,用1%热琼脂糖(用1X的电泳液配制,普通琼脂)封闭玻璃板三边间隙,以防灌胶时漏胶。
2.在三角瓶中配制8%的分离胶20ml,因为目的蛋白分子量较大,因此用8%的分离胶进行电泳检测;GAPDH 用10%分离胶检测。依次加入各成分,每加一种试剂均要混匀。加入TEMED后,立即快速旋动混合物, 并进行下步的操作。
分 离 胶
成 分 体积(20ml)
8% 10%
水 9.3 8.04
30%丙烯酰胺 5.3 6.66
1.5Mtris(Ph8.8) 5.0 5.0
10%过硫酸胺 0.2 0.1
10% SDS 0.2 0.2
TEMED 0.012 0.006
3.迅速在两玻璃板的间隙中灌注分离胶溶液,留出灌浓缩胶所需的空间(比样品梳子长约1cm )。并用小心地在丙烯酰胺溶液的上层覆盖一层异丙醇。以隔绝空气,室温至少放置40min。
4.待分离胶完全聚合后,倾出覆盖层液体,用ddH2O洗涤凝胶顶部数次以除去异丙醇和未聚合的丙烯酰胺,用滤纸拭干残留的ddH2O。
5.依次混合浓缩胶各组分,加入TEMED后,立即快速旋动混合物并在已聚合的分离胶上灌注浓缩胶溶液。在浓缩胶中插入干净的加样梳。室温放置至凝胶完全聚合,一般1-1.5个小时。
5% 积 层 胶
成 分 各成分体积(ml)
2ml 4ml
水 1.4 2.7
30%丙烯酰胺 0.33 0.67
1.5Mtris(Ph8.8) 0.25 0.5
10%过硫酸胺 0.02 0.04
10% SDS 0.02 0.04
TEMED 0.002 0.004

6.将凝胶固定于电泳装置上,上下槽各加入Tris-甘氨酸蛋白电泳缓冲液(pH8.3)。用吸管吸去缓冲液中的气泡,移出样品梳。
7.取组织蛋白40μg加入等体积的2XSDS凝胶加样缓冲液,100℃煮沸5 min。按顺序加入处理好的Maker和待测样品溶液,接通电源,将电压调至70V(约45min),待溴酚蓝进入分离胶后,将电压调为100V,电泳2-3h,当溴酚蓝到达分离胶底部时,停止电泳。
8.电泳结束后,将玻璃板小心从橡胶模子中取出,轻轻地撬开玻璃板,小心取出凝胶,一块胶用来染色:用考马斯亮蓝染色液工作液(0.1%)在染色液中染色4小时左右或过夜,染色完毕后,用蒸馏水洗凝胶后加入脱色液,数小时换一次脱色液,直至背景清晰。在预计分子量范围观察表达蛋白条带,并记下目的蛋白所在的大致位置。另一块胶用来转膜。小心取出凝胶,将目的蛋白所在的胶分别切下,将胶切角标记后,以适量的转移缓冲液将胶在室温平衡15min。
9.同时准备6张滤纸和一张PVDF膜,其大小应与所切凝胶相同。PVDF膜用100%甲醇浸湿(15秒)后,去离子水冲洗3min,然后将PVDF膜和6张滤纸放入转移缓冲液平衡15-30分钟。
10.制备转移三明治:平放底部电极(阳极),放置3张用转移缓冲液浸泡过的滤纸,逐张叠放,精密对齐,然后用玻璃移液管做滚筒以挤出所有的气泡;将PVDF膜放在3层滤纸上,要精确对齐,并且滤纸和PVDF膜之间不留气泡;将漂洗好的凝胶准确平放在PVDF膜上,把凝胶的切角置于PVDF膜的切角标记上(注意膜的切角要大于凝胶的切角,以防止短路);最后把3张滤纸放在凝胶的上面,做成凝胶三明治,剪去多余部分(胶、膜和滤纸务必一样大小),注意用赶走各层气泡。
11将此三明治放入Bio-Rad半干转移仪中,注意检查PVDF膜在下,凝胶在上。
12.根据凝胶面积按5mA/cm2,接通电源,电转时间70min。
13.转移完毕,用丽春红染PVDF膜:PVDF膜首先用纯水漂洗,然后用1X丽春红染色,摇动5-10min)→见蛋白条带→用纯水冲洗数次。拍照
14.将转膜后的胶放入考马斯亮蓝染色液工作液(0.1%)在染色液中染色7然后进行脱色,进行凝胶成像,检测转膜效果。

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