WB的疑问

麻烦哪位高手帮助解答一下我现在做WB遇到的情况，我买的抗体说明书上写的目的条带分子量和实际曝光出来的不一样，Marker肯定没问题了，是国内公司的抗体，问过公司，他们说是蛋白被修饰了，所以会大点。我做的结果比说明书上的大了大概10KD（书上说39KD），不知道公司的解释能不能接受？抗体是多克隆的。就怕他们用别的抗体冒充我要的。

看看你的蛋白质的分子量有没有问题？好多时候，蛋白在翻译后还有好多翻译后修饰，比如说翻译后的甲基化、磷酸化等等，还有蛋白分子的聚合和解聚合，也会导致蛋白分子量和翻译后的有很大的差别。这些修饰和聚合会对蛋白的分子量影响很大。

好多蛋白都是这样子，发挥功能更的蛋白和最初合成的蛋白分子量相差比较大。我最近研究的一个分子就是这样子，在不同的文献上对去分子量的描述不一样，看过大量资料以后才知道：就是由于修饰后的功能蛋白的分子量变大的结果。所以想最近通过western blotting 来做个 验证。祝你成功。

另外也顺便请教一个问题，最近一次的western blotting 没有做出来，最后成像能看见marker的条带，但是就是看不见目标蛋白，整个图像模糊一片，很花。补充说明：整个操作很顺利，就是最后加显像液的时候保鲜膜有点皱。是因为封闭的原因？漂洗？还是什么原因，恳请高手指点？

我先试着解释一下楼主的问题吧。

1、蛋白质的修饰，诸如磷酸化、乙酰化等，会使其分子量稍微变大，但一般不至于从39kDa增至49kDa。所以建议查阅相关文献，看看国外学者做出的此蛋白条带一般在什么位置，是否有不同的varient type。或者从sigma等一些知名厂家网站上搜索针对此蛋白的抗体，关注下他们抗体说明书中的简介及Western blot配图说明，以防你购买抗体说明的印刷失误之类的。

2、如果比照无误，接下来，查看你电泳条件。是否是变性电泳(loading buffer里含有SDS)，因为非变性电泳时蛋白可能会结合配体或受体等其他分子。购买的loading buffer是否质量过关，或者自己配制的话，成分和PH值是否正确。此外，添加buffer前的蛋白质浓度是否相差很大，从而导致蛋白质与SDS结合的比率严重失调，以及之后的上样容积相差过大而导致相邻上样孔之间的推移。这就涉及到下一步确定方法：

3、即，转膜后用丽春红染时，总的蛋白条带是否整齐，有无上下不均、偏移等现象。一般40kDa多的地方会有染色较明显的条带(我不确定此现象是否普遍，是否是内参Actin），与蛋白Marker对比下，感觉如何。

再来试着与楼上的兄弟讨论一下吧。

1、目的蛋白不显影，是否是所检测的组织或细胞中本身就不含有此蛋白。或者含量极低，以至于难以显示出来——可以试着增加每个孔中的上样总蛋白量，增加封闭时一抗的浓度，延长压X片时间。

2、至于你的Marker明显，可能是二抗会一定程度识别Marker蛋白；图像模糊一片，考虑是二抗浓度过高了，或者漂洗没有相应增大时间和次数；当然，发光液与膜之间的孵育最好是不要触碰的；保鲜膜稍皱，稍用力压下就差不多平了(保鲜膜很薄的)。

3、滴加发光液之后不宜等太久再压片，否则局部的发光物质会淬灭的；还有，发光液宜新配，且保存和使用规范哦。

PS：第一次发这么长的帖子回复丁香园的战友们，希望能对同行者有所帮助，当然，叙述不妥的地方，欢迎大虾们斧正。

版主大哥，能给我加分么……

非常感谢你们的帮助！