WB的疑问
丁香园论坛
4896
麻烦哪位高手帮助解答一下我现在做WB遇到的情况,我买的抗体说明书上写的目的条带分子量和实际曝光出来的不一样,Marker肯定没问题了,是国内公司的抗体,问过公司,他们说是蛋白被修饰了,所以会大点。我做的结果比说明书上的大了大概10KD(书上说39KD),不知道公司的解释能不能接受?抗体是多克隆的。就怕他们用别的抗体冒充我要的。
看看你的蛋白质的分子量有没有问题?好多时候,蛋白在翻译后还有好多翻译后修饰,比如说翻译后的甲基化、磷酸化等等,还有蛋白分子的聚合和解聚合,也会导致蛋白分子量和翻译后的有很大的差别。这些修饰和聚合会对蛋白的分子量影响很大。
好多蛋白都是这样子,发挥功能更的蛋白和最初合成的蛋白分子量相差比较大。我最近研究的一个分子就是这样子,在不同的文献上对去分子量的描述不一样,看过大量资料以后才知道:就是由于修饰后的功能蛋白的分子量变大的结果。所以想最近通过western blotting 来做个 验证。祝你成功。
另外也顺便请教一个问题,最近一次的western blotting 没有做出来,最后成像能看见marker的条带,但是就是看不见目标蛋白,整个图像模糊一片,很花。补充说明:整个操作很顺利,就是最后加显像液的时候保鲜膜有点皱。是因为封闭的原因?漂洗?还是什么原因,恳请高手指点?
好多蛋白都是这样子,发挥功能更的蛋白和最初合成的蛋白分子量相差比较大。我最近研究的一个分子就是这样子,在不同的文献上对去分子量的描述不一样,看过大量资料以后才知道:就是由于修饰后的功能蛋白的分子量变大的结果。所以想最近通过western blotting 来做个 验证。祝你成功。
另外也顺便请教一个问题,最近一次的western blotting 没有做出来,最后成像能看见marker的条带,但是就是看不见目标蛋白,整个图像模糊一片,很花。补充说明:整个操作很顺利,就是最后加显像液的时候保鲜膜有点皱。是因为封闭的原因?漂洗?还是什么原因,恳请高手指点?
我先试着解释一下楼主的问题吧。
1、蛋白质的修饰,诸如磷酸化、乙酰化等,会使其分子量稍微变大,但一般不至于从39kDa增至49kDa。所以建议查阅相关文献,看看国外学者做出的此蛋白条带一般在什么位置,是否有不同的varient type。或者从sigma等一些知名厂家网站上搜索针对此蛋白的抗体,关注下他们抗体说明书中的简介及Western blot配图说明,以防你购买抗体说明的印刷失误之类的。
2、如果比照无误,接下来,查看你电泳条件。是否是变性电泳(loading buffer里含有SDS),因为非变性电泳时蛋白可能会结合配体或受体等其他分子。购买的loading buffer是否质量过关,或者自己配制的话,成分和PH值是否正确。此外,添加buffer前的蛋白质浓度是否相差很大,从而导致蛋白质与SDS结合的比率严重失调,以及之后的上样容积相差过大而导致相邻上样孔之间的推移。这就涉及到下一步确定方法:
3、即,转膜后用丽春红染时,总的蛋白条带是否整齐,有无上下不均、偏移等现象。一般40kDa多的地方会有染色较明显的条带(我不确定此现象是否普遍,是否是内参Actin),与蛋白Marker对比下,感觉如何。
再来试着与楼上的兄弟讨论一下吧。
1、目的蛋白不显影,是否是所检测的组织或细胞中本身就不含有此蛋白。或者含量极低,以至于难以显示出来——可以试着增加每个孔中的上样总蛋白量,增加封闭时一抗的浓度,延长压X片时间。
2、至于你的Marker明显,可能是二抗会一定程度识别Marker蛋白;图像模糊一片,考虑是二抗浓度过高了,或者漂洗没有相应增大时间和次数;当然,发光液与膜之间的孵育最好是不要触碰的;保鲜膜稍皱,稍用力压下就差不多平了(保鲜膜很薄的)。
3、滴加发光液之后不宜等太久再压片,否则局部的发光物质会淬灭的;还有,发光液宜新配,且保存和使用规范哦。
PS:第一次发这么长的帖子回复丁香园的战友们,希望能对同行者有所帮助,当然,叙述不妥的地方,欢迎大虾们斧正。
版主大哥,能给我加分么……
1、蛋白质的修饰,诸如磷酸化、乙酰化等,会使其分子量稍微变大,但一般不至于从39kDa增至49kDa。所以建议查阅相关文献,看看国外学者做出的此蛋白条带一般在什么位置,是否有不同的varient type。或者从sigma等一些知名厂家网站上搜索针对此蛋白的抗体,关注下他们抗体说明书中的简介及Western blot配图说明,以防你购买抗体说明的印刷失误之类的。
2、如果比照无误,接下来,查看你电泳条件。是否是变性电泳(loading buffer里含有SDS),因为非变性电泳时蛋白可能会结合配体或受体等其他分子。购买的loading buffer是否质量过关,或者自己配制的话,成分和PH值是否正确。此外,添加buffer前的蛋白质浓度是否相差很大,从而导致蛋白质与SDS结合的比率严重失调,以及之后的上样容积相差过大而导致相邻上样孔之间的推移。这就涉及到下一步确定方法:
3、即,转膜后用丽春红染时,总的蛋白条带是否整齐,有无上下不均、偏移等现象。一般40kDa多的地方会有染色较明显的条带(我不确定此现象是否普遍,是否是内参Actin),与蛋白Marker对比下,感觉如何。
再来试着与楼上的兄弟讨论一下吧。
1、目的蛋白不显影,是否是所检测的组织或细胞中本身就不含有此蛋白。或者含量极低,以至于难以显示出来——可以试着增加每个孔中的上样总蛋白量,增加封闭时一抗的浓度,延长压X片时间。
2、至于你的Marker明显,可能是二抗会一定程度识别Marker蛋白;图像模糊一片,考虑是二抗浓度过高了,或者漂洗没有相应增大时间和次数;当然,发光液与膜之间的孵育最好是不要触碰的;保鲜膜稍皱,稍用力压下就差不多平了(保鲜膜很薄的)。
3、滴加发光液之后不宜等太久再压片,否则局部的发光物质会淬灭的;还有,发光液宜新配,且保存和使用规范哦。
PS:第一次发这么长的帖子回复丁香园的战友们,希望能对同行者有所帮助,当然,叙述不妥的地方,欢迎大虾们斧正。
版主大哥,能给我加分么……
非常感谢你们的帮助!
本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴
师兄微信号:shixiongcoming