【分享】PCR资源

以下为自己参考书籍整理，希望能对新手有一点帮助。我自己也是新手，想和大家共同进步！
影响PCR反应的参数
PCR反应的基本成分
PCR包含7种基本成分
1. 热稳定DNA聚合酶：常规PCR，最常选用Taq DNA聚合酶（每个标准的25～50μl反应体系用0.5～2.5U）。（实验室Taq DNA聚合酶为5U/μl）
2. 一对引物： 这是影响PCR反应的最关键因素。标准PCR反应每条引物的典型浓度是0.1～0.5 μmol/L。（实验室所用引物按要求稀释后，浓度为10μmol/L）
3. dNTP：在Taq DNA聚合酶反应液中包含1.5mmol/L MgCl2 条件下，每种dNTP 浓度一般在200～250μmol/L之间。（实验室dNTP 有2.5 mmol/L和10 mmol/L）（dNTP原液为100～200 mmol/L，购买后最好分装为小份，贮存于－20℃，避免反复冻融，使用前离心数秒）
4. Mg2+：用于激活热稳定DNA聚合酶，其最佳浓度一般为1.5mmol/L。由于dNTP和寡核酸结合dNTP，其摩尔浓度必须大于dNTP 和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。（实验室所用MgCl2为25mmol/L）
5. 维持pH值的buffer：标准PCR缓冲液中Tris－Cl浓度为10mmol/L。室温Tris－Cl将buffer pH值调至8.3～8.8之间，72℃buffer pH值接近7.2。（实验室用10×buffer）
6. 一价阳离子：KCl
7. 模板DNA：高分子量DNA（>10kb）做模板时，用限制性内切酶先行消化（此酶不切割靶序列），扩增效果更好。

PCR反应条件的控制：
1.上述组分的浓度
2.反应温度和循环次数
A 变性温度和时间：90～97℃，通常取95℃、30s
B 退火温度和时间：该温度决定着PCR反应的特异性。合适的退火温度应低于引物Tm值5℃左右。引物和模板退火温度一般在45～55℃之间。退火温度过低，非特异性扩增增多；退火温度过高，PCR扩增产量下降。在Tm允许范围内，选择偏高的退火温度可提高PCR反应的特异性。退火时间一般30s～1min之间足以使引物和模板完全结合。
C 延伸温度和时间：一般72℃左右，此时Taq DNA聚合酶具有较高的酶促活性。延伸时间视扩增片断长度而定。1kb以内的扩增片断，1min即可；3～4kb的靶序列3～4min。
D 循环次数：取决于最初靶分子的浓度，一般25～30次。靶序列拷贝数低，可增加循环次数。

PCR注意事项
1.防治污染的发生和结果的假阳性
2.除实验样品外，应设置阳性对照、阴性对照和试剂对照

PCR引物设计基本要求
1.引物长度：15～30bp
2.引物中碱基组成尽可能随机分布，避免嘌呤、嘧啶堆积现象。引物3’端避免连续3个G和C 。GC一般占引物碱基的45～55％。3’和5’引物Tm值接近。Tm＝4（G+C）+2(A+T).
3.引物自身避免互补序列（≤3bp）和发夹结构。
4.一对引物间避免互补序列，esp3’端
5.引物与非特异性扩增区的序列同源性不要超过70％。引物3’端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列。
6.引物3’端碱基一定与模板配对，最好为G或C。
7.引物与模板结合时，引物5’端可以游离十几个碱基。引物5’端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其他短序列包括起始和终止密码子。