细胞培养染色体显示
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1 ) 传代培养细胞染色体显示法
1 .培养细胞:取处于指数生长期、用较大瓶皿培养的、 80 %~ 90 %汇合单层培养细胞。
2 .加秋水仙素:使用最终浓度为 0.02 ~ 0.8 微克 / 毫升营养液,温箱继续培养 6 ~ 10 小时;或用低温封闭法:把培养细胞置于 4 ℃条件下 6 ~ 12 小时后,再于 37 ℃温箱继续培养 6 ~ 10 小时处理(加秋水仙素)。
3 .采集分裂细胞:可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢特点,此时手持培养瓶,左右反复横向水平摇动,令培养液在培养细胞表面反复冲刷。应用此法可使 90 %的中期分裂细胞从瓶壁脱落,注意勿用力过猛,以防多量非分裂细胞脱落影响观察。
4 .离心:收集培养液, 1000 转 / 分钟离心 5 ~ 10 分钟。
5 .低渗处理:吸除上清液、加入预温至 37 ℃的 0.075M KCl 溶液,在温箱中静置 20 ~ 30 分钟。
6 .预固定:向悬液中加新鲜 1 : 3 醋酸、甲醇固定液 1ml ,用吸管吹打调匀,此措施能起到先使细胞表面轻微固定,可防止固定后细胞粘连成块。
7 .固定:离心,同 4 ,吸除上清液,加新鲜固定剂 5 ~ 10ml ;加固定剂时要用一手微斜持离心管,另手用吸管吸取固定剂,把固定剂逐滴滴在离心管壁上,使之慢慢流入离心管中,然后轻轻吹打均匀,置 15 ~ 20 分钟。
8 .重复 7 ,末次离心后,小心吸除大部分上清,据悬液中细胞密度大小,余下固定液 0.5 ~ 1ml 。
9 .制片:用滴片法制片,按如下步骤:彻底洗净载物片,勿留任何油脂,置冰箱中储备备用。滴片前现从冰箱中取出冷载物片 1 片,在载物片表面出现细微水气时,立即向片的一侧滴 2 ~ 3 滴细胞悬液,滴片时的距离能保持半米高度才好。滴片后置室温中令其自然干燥,或用吹风机热风吹干亦可。如此制备好的标本可置盒中备用或立即进行染色观察。
10 . 染色和封片:一般常用 Giemsa 染色:取干液 Giemsa 1 份加 pH6.8 磷酸缓冲液 9 份混合,染色 10 分钟后,水洗、晾干、可直接观察。如标本需要保存或做长时间观察,可过二甲苯两次后,用中性树胶封片后,再过二甲苯,然后封片亦可。
2 ) 人末梢血微量全血培养染色体显示法
1 .培养液准备:取 15ml 培养瓶数个,每瓶内分别充入 5ml 培养液( pH 7.2 ),内含: 1640 培养液(含 10 %~ 15 %小牛血清), PHA 0.1ml ,青霉素 100 单位和链霉素 100 微克 / 毫升 培养液
2 .抽血针管准备:取 2 ~ 5ml 针管一支,在消毒后的无菌操作台或无菌操作箱中安装好注射器,无菌抽肝素( 100 U/ml BBS )少许湿润针管,如动作迅速不用肝素亦可。
3 .采血:用棉签 75 %酒精给患者或献血者的皮肤消毒两次,缚止血带,静脉取血 1 ~ 2ml 。无菌操作迅速向每一瓶培养中加血 0.4 ~ 0.5ml ,如系外出采血,安装针管及分装血液两步骤亦可在无菌条件略差的环境内操作,但动作要迅速,以减少污染;在采血量不多或不应抽血的情况下,亦可在耳垂、手指肚(无名指)用刺血针采血。
4 .培养和加秋水仙素: 37 ℃温箱中培养到 60 ~ 72 小时之间,此时细胞分裂相最多,向每培养瓶内加秋水仙素,最终浓度 0.02 ~ 0.08 微克 / 毫升营养液,再培养 4 ~ 6 小时。
5 .低渗: 1000 转 / 分钟离心 10 分钟,吸除上清液,加入预温过的 0.075M KCl 溶液 10ml ,置温箱中低渗处理 15 ~ 20 分钟。
6 .其余步骤与处理传代细胞法相同。