染色体结构显示和检测
互联网
染色体结构显示和检测
1） 染色体显带
显 Q 带法
1. 漂洗：取经过干热预处理或已老化的染色体标本，置于 pH6.0 缓冲液中浸 5~10 分钟。
2. 染色：浸入 pH6.0 的 GM 或 QD 染液中 5~10 分钟。
3. 漂洗：浸入新鲜 pH6.0 缓冲液中漂洗两次，每次 5 分钟。
4. 观察：向标本染色体面滴 1~2 滴新鲜缓冲液，覆以盖片（避免出气泡），置荧光显微镜下观察。
显 G 带法
胰酶 -Giemsa 混合显带法
1． 预处理：取中期染色体标本，置 60 ℃～ 60 ℃温箱中 20 ～ 30 分钟，或在 37 ℃温箱过夜，然后浸入 0.025M 磷酸缓冲液中， pH6.8 ， 56 ℃温浴 10 分钟。
2． 消化和染色：用现配制的胰蛋白酶 -Giemsa 混合液消化和染色 10 ～ 30 分钟，混合液按如下比例配制：
0.025 M 磷酸缓冲液 pH6.8 73.0 ml
甲醇 27.0 ml
Giemsa 干粉 50.0 mg
0.25% 胰酶 0.3 ～ 0.4 ml
3． 封片：染色后用自来水冲洗，入蒸馏水漂洗数次、晾干、二甲苯透明 2~3 分钟，封入中性树脂中。
Giemsa 显带法
1． 预处理：将标本置入 60~80 ℃温箱或烤箱中 20~30 分钟，亦可在 37 ℃温箱过夜。
2． 胰酶消化：用 0.85% 的 NaCl 配制 0.25% 胰蛋白酶溶液消化 3~5 分钟。
3． 染色：取出标本片，先直立于吸水纸上除去多余胰酶液后，随即置入 Giemsa 染液中，染 10 分钟。
4． 封片：自来水洗，蒸馏水漂洗，晾干，二甲苯透明 2~3 分钟，封入中性树胶中。
2） 姐妹染色单体分化染色
BUdR 掺入和制片程序
1． BUdR 培养液制备：先制备好含 BUdR 的培养液（最终浓度为 3~10 微克 / 毫升）。
2． BUdR 掺入：如用传代细胞，在末次传代后，改换用含 BUdR 的培养液培养。如为人末梢血细胞，一开始就用含 BUdR 培养液培养（培养瓶放在特制黑色木盒、黑布中或黑纸包裹） 37 ℃温箱内培养。
3． 中止掺入与制片：待细胞经历两个细胞周期（人周围血细胞培养 48 或 72 小时）
4． 加秋水仙素 ― 制片。
姐妹染色单体分化染色
方法一
1． 老化：中期染色体标本老化 1~2 天。
2． 预处理：放入预热至 85~89 ℃的 1 M NaH2 PO4 处理 15 分钟。
3． 制片：然后用温蒸馏水轻轻漂洗，蒸馏水冲洗，晾干， Giemsa 液染色 10 分钟，晾干，二甲苯透明，封固。
方法二：即 FPG 法
1． 标本：掺入 BUdR 后的中期染色体标本。
2． 荧光染色：用荧光染料 Hoechst 33258 （用 pH7.0 Sorensen 缓冲液配制，浓度为 0.5 微克 / 毫升）染色 12~15 分钟。
3． 黑光灯照射：自来水冲洗，加 1 滴 pH8.0 缓冲液，覆以盖片，用黑光灯照射（ 20 W ），距离 5 厘米，时间半小时。
4． 温浴： 50~60 ℃热的 2 × SSC 液温育 2 小时，蒸馏水冲洗，晾干。
5． 染色： pH6.8 的 2%Giemsa 染色 15 分钟，透明封固。
方法三
1． 标本：掺入 BUdR 后的中期染色体标本，置 30 瓦日光灯下，灯距 3 厘米，照射 6 小时。
2． 温浴：用 2 × SSC 液（ 60 ℃）处理 15 分钟。
3． Giemsa 染色 10 分钟，也可获得满意的标本。
3） 染色体脆性位点的检测
为提高检出率，可采取以下措施：
1． 在培养时把血清量降到 5% 。
2． 用不含叶酸的 MEM-Fra 培养基培养。
3． PH 调至 7.5 。
4） 微核检测
方法一：
1． 采血：静脉采血 0.5ml ，肝素抗凝，用小方瓶培养，加培养液 5ml 。培养液租成为：含 20% 小牛血清的 Eagle 液，加 PHA 40 微克 / 毫升。
2． 培养：置 37 ℃温箱内培养 48 或 72 小时，以 1000rpm 离心 8 分钟。
3． 固定： 3 ： 1 甲醇 / 冰醋酸固定 3 次，每次 15 分钟，离心沉淀固定液。
4． 制片：冷冻载片滴片法制片，自然干燥， 10%Giemsa （ pH6.8 ）染色 15 分钟。
方法二
1． 采血：肝素抗凝血 0.5~0.6ml ，置 10ml 试管中，加入血量一半的 0.5% 甲基纤维素，充分混合。
2． 培养：置 37 ℃温箱中静置培养 30 分钟，以 2000rpm 离心 10 分钟，去上清液。
3． 制片：做涂片， Wright 法染色。
方法三
1． 采血：用三棱针刺无名指取血 0.6ml ，立即注入内径 3mm ，长 5cm 的血液沉淀管中，用小玻璃棒搅拌除去纤维蛋白。
2． 加明胶：加入 3% 的明胶，小心混匀，置 37 ℃温箱自然沉降 50 分钟。
3． 吸去上清液，离心，沉淀物涂片，自然干燥， Wright 染色 30 分钟，再用 Giemsa 染色 2 分钟。
5） 非程序 DNA 合成检测（ UDS ）
放射自显影 UDS 的测定：
1． 细胞培养： WI-38 成纤维细胞，完全培养液支持物盖片培养法培养，细胞生长至汇合时。
2． 抑制 DNA 合成：弃旧培养液，加入不含精氨酸的 EMEM 培养液，继续培养 20~24 小时。
3． 加测试物：加入 10mM 羟基脲（阳性对照加 MNNG ），培养 2 小时。
4． H-TdR 处理： 2 、 3 、 4 每皿内加 3 H-TdR 后，培养 20~24 小时。
5． 漂洗：去除培养液，用不含钙、镁 BSS 漂洗。
6． 制片：制备放射自显影标本方法固定细胞、涂胶、曝光、显影及染色。
7． 观察：在油镜下计数，首先要排除 S 期半保留复制细胞（为银粒覆盖的细胞核），只计数核上的银粒数目，再扣除本底，结果以银粒数 / 核的均值或含 10 个银粒左右细胞的百分率表示。
液闪计数法：
1． 细胞培养和处理：人二倍体成纤维细胞：接种在培养皿中培养。
2． 加培养液、 MNNG 、羟基脲，以及 3 H-TdR 处理等于前 5 项相同。自（ 5 ）漂洗后。
3． 消化：用 0.25% 胰蛋白酶消化，制成悬液。
4． 液闪计数标本制备： 10% 三氯醋酸处理，将细胞收集在玻璃纤维滤纸片上，无水乙醇脱水烤干，置液闪杯中，加闪烁液，置液闪计数仪上计数。结果以 dpm/106 细胞或 cpm/ 每皿细胞表示。
