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染色体结构显示和检测

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染色体结构显示和检测

 

1)  染色体显带

Q 带法

1.      漂洗:取经过干热预处理或已老化的染色体标本,置于 pH6.0 缓冲液中浸 5~10 分钟。

2.      染色:浸入 pH6.0 GM QD 染液中 5~10 分钟。

3.      漂洗:浸入新鲜 pH6.0 缓冲液中漂洗两次,每次 5 分钟。

4.      观察:向标本染色体面滴 1~2 滴新鲜缓冲液,覆以盖片(避免出气泡),置荧光显微镜下观察。

 

 

G 带法

胰酶 -Giemsa 混合显带法

1. 预处理:取中期染色体标本,置 60 ℃~ 60 ℃温箱中 20 30 分钟,或在 37 ℃温箱过夜,然后浸入 0.025M 磷酸缓冲液中, pH6.8 56 ℃温浴 10 分钟。

2. 消化和染色:用现配制的胰蛋白酶 -Giemsa 混合液消化和染色 10 30 分钟,混合液按如下比例配制:

0.025 M 磷酸缓冲液 pH6.8           73.0 ml

 

甲醇                                  27.0 ml

 

Giemsa 干粉                           50.0 mg

 

0.25% 胰酶                            0.3 0.4 ml

3. 封片:染色后用自来水冲洗,入蒸馏水漂洗数次、晾干、二甲苯透明 2~3 分钟,封入中性树脂中。

 

 

Giemsa 显带法

1. 预处理:将标本置入 60~80 ℃温箱或烤箱中 20~30 分钟,亦可在 37 ℃温箱过夜。

2. 胰酶消化:用 0.85% NaCl 配制 0.25% 胰蛋白酶溶液消化 3~5 分钟。

3. 染色:取出标本片,先直立于吸水纸上除去多余胰酶液后,随即置入 Giemsa 染液中,染 10 分钟。

4. 封片:自来水洗,蒸馏水漂洗,晾干,二甲苯透明 2~3 分钟,封入中性树胶中。

 

 

2)  姐妹染色单体分化染色

BUdR 掺入和制片程序

 

1. BUdR 培养液制备:先制备好含 BUdR 的培养液(最终浓度为 3~10 微克 / 毫升)。

2. BUdR 掺入:如用传代细胞,在末次传代后,改换用含 BUdR 的培养液培养。如为人末梢血细胞,一开始就用含 BUdR 培养液培养(培养瓶放在特制黑色木盒、黑布中或黑纸包裹) 37 ℃温箱内培养。

3. 中止掺入与制片:待细胞经历两个细胞周期(人周围血细胞培养 48 72 小时)

4. 加秋水仙素 制片。

 

 

姐妹染色单体分化染色

 

方法一

1. 老化:中期染色体标本老化 1~2 天。

2. 预处理:放入预热至 85~89 ℃的 1 M NaH2 PO4 处理 15 分钟。

3. 制片:然后用温蒸馏水轻轻漂洗,蒸馏水冲洗,晾干, Giemsa 液染色 10 分钟,晾干,二甲苯透明,封固。

 

 

方法二:即 FPG

1. 标本:掺入 BUdR 后的中期染色体标本。

2. 荧光染色:用荧光染料 Hoechst 33258 (用 pH7.0 Sorensen 缓冲液配制,浓度为 0.5 微克 / 毫升)染色 12~15 分钟。

3. 黑光灯照射:自来水冲洗,加 1 pH8.0 缓冲液,覆以盖片,用黑光灯照射( 20 W ),距离 5 厘米,时间半小时。

4. 温浴: 50~60 ℃热的 2 × SSC 液温育 2 小时,蒸馏水冲洗,晾干。

5. 染色: pH6.8 2%Giemsa 染色 15 分钟,透明封固。

 

 

方法三

1. 标本:掺入 BUdR 后的中期染色体标本,置 30 瓦日光灯下,灯距 3 厘米,照射 6 小时。

2. 温浴:用 2 × SSC 液( 60 ℃)处理 15 分钟。

3. Giemsa 染色 10 分钟,也可获得满意的标本。

 

 

3)  染色体脆性位点的检测

 

为提高检出率,可采取以下措施:

1. 在培养时把血清量降到 5%

2. 用不含叶酸的 MEM-Fra 培养基培养。

3. PH 调至 7.5

 

 

4)  微核检测

 

方法一:

1. 采血:静脉采血 0.5ml ,肝素抗凝,用小方瓶培养,加培养液 5ml 。培养液租成为:含 20% 小牛血清的 Eagle 液,加 PHA 40 微克 / 毫升。

2. 培养:置 37 ℃温箱内培养 48 72 小时,以 1000rpm 离心 8 分钟。

3. 固定: 3 1 甲醇 / 冰醋酸固定 3 次,每次 15 分钟,离心沉淀固定液。

4. 制片:冷冻载片滴片法制片,自然干燥, 10%Giemsa pH6.8 )染色 15 分钟。

 

 

方法二

1. 采血:肝素抗凝血 0.5~0.6ml ,置 10ml 试管中,加入血量一半的 0.5% 甲基纤维素,充分混合。

2. 培养:置 37 ℃温箱中静置培养 30 分钟,以 2000rpm 离心 10 分钟,去上清液。

3. 制片:做涂片, Wright 法染色。

 

 

方法三

1. 采血:用三棱针刺无名指取血 0.6ml ,立即注入内径 3mm ,长 5cm 的血液沉淀管中,用小玻璃棒搅拌除去纤维蛋白。

2. 加明胶:加入 3% 的明胶,小心混匀,置 37 ℃温箱自然沉降 50 分钟。

3. 吸去上清液,离心,沉淀物涂片,自然干燥, Wright 染色 30 分钟,再用 Giemsa 染色 2 分钟。

 

 

5)  非程序 DNA 合成检测( UDS

放射自显影 UDS 的测定:

 

1. 细胞培养: WI-38 成纤维细胞,完全培养液支持物盖片培养法培养,细胞生长至汇合时。

2. 抑制 DNA 合成:弃旧培养液,加入不含精氨酸的 EMEM 培养液,继续培养 20~24 小时。

3. 加测试物:加入 10mM 羟基脲(阳性对照加 MNNG ),培养 2 小时。

4. H-TdR 处理: 2 3 4 每皿内加 3 H-TdR 后,培养 20~24 小时。

5. 漂洗:去除培养液,用不含钙、镁 BSS 漂洗。

6. 制片:制备放射自显影标本方法固定细胞、涂胶、曝光、显影及染色。

7. 观察:在油镜下计数,首先要排除 S 期半保留复制细胞(为银粒覆盖的细胞核),只计数核上的银粒数目,再扣除本底,结果以银粒数 / 核的均值或含 10 个银粒左右细胞的百分率表示。

 

 

液闪计数法:

 

1. 细胞培养和处理:人二倍体成纤维细胞:接种在培养皿中培养。

2. 加培养液、 MNNG 、羟基脲,以及 3 H-TdR 处理等于前 5 项相同。自( 5 )漂洗后。

3. 消化:用 0.25% 胰蛋白酶消化,制成悬液。

4. 液闪计数标本制备: 10% 三氯醋酸处理,将细胞收集在玻璃纤维滤纸片上,无水乙醇脱水烤干,置液闪杯中,加闪烁液,置液闪计数仪上计数。结果以 dpm/106 细胞或 cpm/ 每皿细胞表示。

 

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