T 细胞克隆的制备
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细胞克隆，是将一个单细胞从细胞群中分离出来单独培养，使之重新繁衍成一个新的单一细胞群的培养技术。未经克隆化的细胞具有异质性，经过克隆得到的是均一细胞集团。这里仅介绍T细胞与NK 细胞的克隆方法。
基本原理
用限度稀释克隆形成法制备T 细胞克隆时，并非依赖细胞 的特性，而是将T 细胞在细胞培养板上稀释到统计学的浓度，即从理论值上达到每孔1 个细胞，其中加入IL－2 和PHA 可增强细胞的生长，而加入的同种异体PBMC 作为饲养细胞，在这种体系中，单个T 细胞可增殖生长成细胞集团，即T 细胞克隆。
试剂和材料
●提纯T 细胞（参见第一章之第六节）
● 饲养细胞（以50GYγ射线照射）：从两个不同供者获得的同种异体PBMC从理论上认为两者的每一演变均不同。
● 培养基：RPMI1640 培养液（RPMI1640 液＋1mmol/L 丙酮酸钠＋2mmol/L 谷氨酰胺＋100u/ml青霉素和100μg/ml 链霉素）再加入热灭活的10％的AB 型血清。
● 按说明书所述，将PHA－A 溶于双蒸水中。
● 含有104u/ml hrIL－2 的PBS 液中加入1％牛血清白蛋白（BSA）。
● 器皿、 仪器 ：96 孔U 型低细胞培养板及24 孔细胞培养板，垂直气流超净台，CO 2 孵箱，倒置显微镜等。
实验操作
1.培养板的准备
1） 应用典型的有限稀释克
隆形成法，以0．5 个/孔、1 个/孔、5 个/孔等三种不同细胞浓度准备三块96 孔U 型培养板，以及半块
为10 个/孔浓度的96 孔培养板。
2） 准备含有5×10 5 /ml 饲养细胞（经γ射线照射）的RPMI1640培养液，并加入20u/ml 的IL－2 和1μg/ml PHA－A。
3） 在3 块半96 孔板上，每孔均加入100μl 饲养细胞（50000个）。
4） 准备稀释T 细胞的培养（图2－3）
5） 如图2－3 所示，准备3 支15ml 试管，内含5ml 细胞培养液（CM）加20u/ml IL－2，将4 支试管分别稀释并接种96 孔板，步骤如下：
（1） 第1 管加50μl 稀释液C，相当50 个细胞，混匀后加在96 孔板上，50μl/孔，此板为0．5 细胞/孔。
（2） 第2 管加100μl 稀释液C，相当100 个细胞，混匀后加在96 孔板上，50μl/孔，此板为1 细胞/孔。
（3） 第3、4 管各加500μl 稀释液C，相当500 个细胞，第3 管为500 细胞/5mlCM,，混匀后加在96 孔板上，50μl/孔，此板为5 细胞/孔; 第4 管为500 细胞/2．5mlCM,，混匀后仅够加半个板，50μl/孔，此板为10 个细胞/孔。
4 块96 孔板上有50μl 不同浓度T 细胞悬液加到含有100μl 饲养细胞的各孔中（IL－2 的终浓度应为20u/ml）。
2.T细胞克隆培养
1） 如图2－4 所示，每隔2－3 天吸弃50μl培养上清液，加入50μl 含有IL－2 的新鲜培养液，使其终浓度达20u/ml；每隔10－15 天吸弃50μl 培养上清液，加入50μl 含有新鲜饲养细胞（50000/孔）、IL－2（终浓度达20u/ml）和PHA－A（终浓度达1μg/ml）的培养液。2） 经21－25 天后出现克隆细胞生长孔，首先在10 细胞/孔的板上出现，当在1 细胞/孔的板上出现克隆生长时，即可将5 细胞/孔和10 细胞/孔的两块板丢弃。
3） 当0．5 细胞/孔和1 细胞/孔两板上长出的细胞克隆变大时，将该孔的100μl 培养液悬浮混匀，分装于96 孔板2 个孔内，50μl/孔，而且每孔已预先加有上述饲养细胞（50000/孔）。
4） 随着细胞的继续生长，用同法可将同一克隆细胞分装扩充为4 孔，当分装成8 孔时，可汇总这8 孔的细胞转移至24 孔板的1 孔内。
5） T 细胞克隆可在如此条件下维持其生长，即每隔2－3 天更换含有IL－2（20u/ml）的新鲜培养液，每隔10－15 天更换含有新鲜饲养细胞、IL－2（20u/ml）和PHA（1μg/ml）的培养液，其中加入饲养细胞的比率应为T 细胞克隆细胞数0．5－1×106 细胞需106 饲养细胞。
质控与提示
1.细胞克隆的性能可用抗TCRVβ片段的抗体在流式细胞仪上进行检测，或用分子 生物 学方法（如RT－PCR）去检测TCR－Vβ转录产物。
2.最好在一检出阳性克隆时就开始进行亚克隆。
3.某些T 淋巴细胞亚群不能在这一系统（如饲养细胞＋PHA 环境）中增殖，但此系统对获得克隆的总体要比接种细胞的数量更为有效。
4.必须使饲养细胞受到充分照射，以保证长出的细胞是T 细胞克隆，而不是饲养细胞。
（可用流式细胞仪、分子 生物 学方法或HLA 分型等检测）。
基本原理
用限度稀释克隆形成法制备T 细胞克隆时，并非依赖细胞 的特性，而是将T 细胞在细胞培养板上稀释到统计学的浓度，即从理论值上达到每孔1 个细胞，其中加入IL－2 和PHA 可增强细胞的生长，而加入的同种异体PBMC 作为饲养细胞，在这种体系中，单个T 细胞可增殖生长成细胞集团，即T 细胞克隆。
试剂和材料
●提纯T 细胞（参见第一章之第六节）
● 饲养细胞（以50GYγ射线照射）：从两个不同供者获得的同种异体PBMC从理论上认为两者的每一演变均不同。
● 培养基：RPMI1640 培养液（RPMI1640 液＋1mmol/L 丙酮酸钠＋2mmol/L 谷氨酰胺＋100u/ml青霉素和100μg/ml 链霉素）再加入热灭活的10％的AB 型血清。
● 按说明书所述，将PHA－A 溶于双蒸水中。
● 含有104u/ml hrIL－2 的PBS 液中加入1％牛血清白蛋白（BSA）。
● 器皿、 仪器 ：96 孔U 型低细胞培养板及24 孔细胞培养板，垂直气流超净台，CO 2 孵箱，倒置显微镜等。
实验操作
1.培养板的准备
1） 应用典型的有限稀释克
隆形成法，以0．5 个/孔、1 个/孔、5 个/孔等三种不同细胞浓度准备三块96 孔U 型培养板，以及半块
为10 个/孔浓度的96 孔培养板。
2） 准备含有5×10 5 /ml 饲养细胞（经γ射线照射）的RPMI1640培养液，并加入20u/ml 的IL－2 和1μg/ml PHA－A。
3） 在3 块半96 孔板上，每孔均加入100μl 饲养细胞（50000个）。
4） 准备稀释T 细胞的培养（图2－3）
5） 如图2－3 所示，准备3 支15ml 试管，内含5ml 细胞培养液（CM）加20u/ml IL－2，将4 支试管分别稀释并接种96 孔板，步骤如下：
（1） 第1 管加50μl 稀释液C，相当50 个细胞，混匀后加在96 孔板上，50μl/孔，此板为0．5 细胞/孔。
（2） 第2 管加100μl 稀释液C，相当100 个细胞，混匀后加在96 孔板上，50μl/孔，此板为1 细胞/孔。
（3） 第3、4 管各加500μl 稀释液C，相当500 个细胞，第3 管为500 细胞/5mlCM,，混匀后加在96 孔板上，50μl/孔，此板为5 细胞/孔; 第4 管为500 细胞/2．5mlCM,，混匀后仅够加半个板，50μl/孔，此板为10 个细胞/孔。
4 块96 孔板上有50μl 不同浓度T 细胞悬液加到含有100μl 饲养细胞的各孔中（IL－2 的终浓度应为20u/ml）。
2.T细胞克隆培养 1） 如图2－4 所示，每隔2－3 天吸弃50μl培养上清液，加入50μl 含有IL－2 的新鲜培养液，使其终浓度达20u/ml；每隔10－15 天吸弃50μl 培养上清液，加入50μl 含有新鲜饲养细胞（50000/孔）、IL－2（终浓度达20u/ml）和PHA－A（终浓度达1μg/ml）的培养液。2） 经21－25 天后出现克隆细胞生长孔，首先在10 细胞/孔的板上出现，当在1 细胞/孔的板上出现克隆生长时，即可将5 细胞/孔和10 细胞/孔的两块板丢弃。
3） 当0．5 细胞/孔和1 细胞/孔两板上长出的细胞克隆变大时，将该孔的100μl 培养液悬浮混匀，分装于96 孔板2 个孔内，50μl/孔，而且每孔已预先加有上述饲养细胞（50000/孔）。
4） 随着细胞的继续生长，用同法可将同一克隆细胞分装扩充为4 孔，当分装成8 孔时，可汇总这8 孔的细胞转移至24 孔板的1 孔内。
5） T 细胞克隆可在如此条件下维持其生长，即每隔2－3 天更换含有IL－2（20u/ml）的新鲜培养液，每隔10－15 天更换含有新鲜饲养细胞、IL－2（20u/ml）和PHA（1μg/ml）的培养液，其中加入饲养细胞的比率应为T 细胞克隆细胞数0．5－1×106 细胞需106 饲养细胞。
质控与提示
1.细胞克隆的性能可用抗TCRVβ片段的抗体在流式细胞仪上进行检测，或用分子 生物 学方法（如RT－PCR）去检测TCR－Vβ转录产物。
2.最好在一检出阳性克隆时就开始进行亚克隆。
3.某些T 淋巴细胞亚群不能在这一系统（如饲养细胞＋PHA 环境）中增殖，但此系统对获得克隆的总体要比接种细胞的数量更为有效。
4.必须使饲养细胞受到充分照射，以保证长出的细胞是T 细胞克隆，而不是饲养细胞。
（可用流式细胞仪、分子 生物 学方法或HLA 分型等检测）。
