T H L 的准备

T H L 的准备

材料

试剂

仪 器

超 声 波 清 洗 仪

手 动 挤 压 机（如 Iiposofast 手 动 挤 压 机 ， Avestin) 和 聚 碳 酸 酯 滤 器 ，孔 径 为 4 〇〇 nm和 IOOnm 各 两 个（也 可 能 需 要 50nm; 见 步 骤 4)

凝 胶 过 滤 层 析 装 置

玻 璃 管（12m m X 75m m )

Millipore Millex-GV 滤 器（0. 22um )

激 光 力 度 分 析 仪

调 速 摇 床

旋 转 蒸 发 仪（可 选 ，见 步 骤 4)

闪 烁 计 数 仪

分 光 光 度 计

涡 旋 器

方法

1 . 放 射 标 记 M A b 。

通过确定连接到 T H L 上 的 M A b 的分子数来作为每批 T H L 质控指标的一部分

a. 用 N S P 标 记 M A b 上 赖 氨 酸 残 基 上 的 e-氨基也 可 用 [ 125I ] 碘和氯胺 T 或四氯二苯基苷脲进行放射标记。在一个月之后丢弃 125I 标记的MAb,3 H 标 记 的 M Ab 可在一 20℃ 储 存 6〜12 个月。

b. 在 每 次 生 成 T H L 反 应 之 前 测 定 放 射 标 记 的 M A b 的 T C A 沉 淀 率 。

c. 用 凝 胶 过 滤 层 析 纯 化 T C A 沉 淀 率 小 于 9 5 % 的 M A b 。

2• 以 切口平移法用 32P 放 射 标 记 质 粒 D N A 的 一 部 分 ，测 量 被 包 裹 在 T H L 内 部 的 D N A的 量 ，作 为 每 批 T H L 的 质 控 指 标 。在 4 °C 储 存 IO d 后 ，丢 弃 32P 标 记 的 质 粒 。

3• 将 M A b 的 巯 基 与 D SPE-P E G 2000-马 来 酰 亚 胺 的 马 来 酰 亚 胺 基 连 接 形 成 稳 定 的 硫 醚键 。用 如 下 方 法 硫 醇 化 M A b :

a. 在 一 个 1 2mmX 75m m 玻 璃 管 中 准 备 如 下 溶 液 ：
3.Omg M A b (20n m ol)

2uCi3 H 标 记 M A b

约 200ul 0 . 15m o l/L 硼 酸 钠 缓 冲 液 (p H 8. 5 )/E D T A (0. lm m o l/ L )

b. 加 人 1200nm ol T ra u t 试 剂 。

当 靶 向 M Ab 为 小 鼠 IgG2a 同 型 物 时（如 0 X2 6 或 83-14MAb) , 其 与 M Ab 之间的摩尔比为6 0 : 1 ，当 靶 向 M Ab 为 大 鼠 IgG (如 8D3 MAb) 时 ，用 4 0 : 1 作为摩尔比。 目的是为了在每 个 MAb 上 多 添 加 1〜1. 5 个巯基。

c. 用 E llm a n 试 剂 和 分 光 光 度 计 法 确 定 巯 基 的 数 目 。

如 果 每 个 MAb 上 的 巯 基 的 数 目 大 于 1 . 5 , 可能发生了 M Ab 分子内交联。如 果 每 个 MAb上的巯基的数目小于 1. 〇 ， M Ab 与脂质体的结合效率将会降低。

4 . 脂质体的生成和析出步骤如下：

a . 在加人 Im l 氯仿的 12 mmX75 mm 玻璃管中准备如下溶液：

18.6/nmol POPC

0.6umol DDAB

0.6umol DSPE-PEG 2000

0.2umol DSPE-PEG 2000-马来亚酰胺

b. 在氮气流下完全蒸发溶液，同时持续涡旋以产生薄液膜层。
也可用旋转蒸发仪代替。小心生成薄液膜层。

c•加人 300ul 0.05mol/L HEPES (pH7.0 ) 水化脂质，使之大约为 100 mmol/L。

水化和随后的涡旋要小心处理没有中断。

d•将水化的脂质在超声波清洗仪中放置 2m i n ，最大速度涡旋 l m i n 。用激光力度分析仪以动态散射颗粒测量技术确定脂质体的直径。在水化、涡旋和超声处理后，脂质体的大小应该是 500〜lOOOnm。在处理过程中随时监控脂质体的大小。

e•在水化的脂质中加人质粒 DNA (100〜250ug ) 和 大 约 Iu C i 的 32P 标记的质粒 DNA。

f. 在液氮或者干冰或乙醇浴中冰冻混合物 5m i n , 37°C 溶解脂质 lOmiri。重复这个循环.5〜7 次。

质 粒 D N A 在重复的冻融过程中被包裹在大的脂质体中。如果样品中有过量的气泡则会干扰下一步的析出过程，应该被除去。

g.加人 H E P E S 缓 冲 液（0.05m o l/L ， p H 7.0)，使 脂 质 终 体 积 大 约 为 500ul 或40 mmol/L

h•为了降低脂质体的大小，在手动挤压机上用两层叠加的 400nm 孔径的聚碳酸酯滤膜过滤脂质/D N A 混合物。重 复 5 次。将两层叠加的 IOOnm 孔径的聚碳酸酯滤膜放入挤压机中，过滤脂质/D N A 混合物 5 次。

此时脂质体的最佳直径应该是 80〜120nm , 达到这个直径可能需要将混合物过双层孔径为50n m 的滤膜。

5.按如下步骤进行核酸酶降解：

a. 向脂质体中加人胰腺内切核酸酶 I 和外切核酸酶 III， 37°C 孵 育 60m i n 。

如果析出过程操作正确会有 4 〇 % 〜6 〇 % 的 D N A 包 裹 在 IOOnm 的脂质体中，但仍有残存。

这些未被包裹的 D N A 在体内有毒性必须被去除。正因为如此需要核酸酶的作用（Monnardetal. 1997)。

b . 加人终浓度为2Ommol/L 的 EDTA 终止反应。

不推荐用强阴离子交换柱如 D EA E 去 除 外 部 D N A , 因为它不能去除静电贴附在脂质体表面带正电脂质残基上的阴离子 DNA。 用 D EA E 柱 进 行 的 T H L 纯化会含有大量的未被包裹的 D N A , 从而导致体内毒性和炎症反应（Norman etal. 2000)。

6.连接和凝胶过滤层析过夜：

a. 把核酸酶处理的 P E G y Ia te d 脂质体和硫醇化的 M A b 混合。

b. 封闭溶液，加人氮气，室温下轻微振荡过夜。

C•将预备液加人用 0. 05m o l / L H E P E S (p H 7. 0 ) 平衡的 I.5c m X 20c m 的 Sepharose C L -4B 柱。在室温下用 H E P E S 缓冲液以 l m l/m i n 的速度洗柱，收 集 Iml片 段（H u w y l e r et al.1996)。

A 数出每个片段的 3 H 和 32P 的放射活性。3 H /32P 双同位素闪烁计数，3 H 在 0-16k eV窗口计数, 32P 在 16〜1700k e V 窗口计数。

e•用 C L -4B 柱的第一个或脂质体峰的 32P 的放射活性来确定被包裹 D N A 的百分数。

f•用同一个峰 3 H 的放射活性来计算单个 T H L 结合 M A b 分子的数目。

T H L 在 片 段 1 0 , 大 约 IOml 洗脱体积时候出峰。未共价结合的 M A b 洗脱体积大约在 25m l,核酸酶降解的核苷酸在 30〜35m l 处洗脱。在 32P 通道里没有 3 H 的溢出，但是在 3 H 通道里大 概 有 2 % 的 32P 溢出。在计算 3 H 和 32P 的放射活性时溢出应该被考虑在内。

7 .在使用 T H L 之前，用 0.22M m W M i l l i p 0re Millex-G V 滤膜过滤除菌，这样不会改变其结构整体性（Z h a n etal.2002b )。在 T H L 生成后 24 h 内用于培养的细胞或注射人动物体内，如果在 C L -4B 柱洗脱的同一天内应用更佳。 T H L 可 在 4°C 储存过夜。