时间分辨荧光免疫分析技术

一、前言

近百年来，“特效试剂”一直是分析化学家追求的目标。所谓“特效试剂”，就是指的是只与一种待测物质反应的试剂。事实上，目前使用的所谓的“铜试剂”、“铁试剂”、“硝酸试剂”等等，都是“盛名之下，其实难副”的。20世纪40-50年代追求合成特效试剂的狂热，早已降温。正在分析化学家心灰意冷之际，人们从免疫学与生物化学的成就看到了这一理想的曙光：免疫系统简直就是天然存在的一部特异性试剂的合成机器。抗原与抗体之间的免疫反应具有高度的特异性，这种识别的专一性超过酶对底物的识别水平，抗原-抗体复合物的稳定常数一般为109，有些高达1010-1015，具有很高的稳定性。免疫反应的特点使得免疫分析已成为一个跨学科的新型分析技术，广泛应用于临床体液分析、药物分析、环境分析、食品分析和生物化学研究，尤其在毒品的鉴定、吸毒人员的认定和疾病的诊断方面，发挥了重要作用。

时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）是自80年代以来新发展起来的一种新型分析技术，与其它免疫分析技术相比，有其独特的优点。它克服了放射性免疫分析法（RIA）中放射性同位素带来的污染问题；克服了酶免疫分析法（EIA）中酶不稳定的缺点；而且，由于TRFIA法能够很好的消除背景荧光的干扰，使其灵敏度比普通荧光法（FIA）高出几个数量级。正是由于TRFIA的独特优点，使得它成为免疫分析中最有发展潜力的一种分析方法。

二、时间分辨荧光免疫分析的原理

时间分辨荧光免疫分析的原理就是使用三价稀土离子（如Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+）作为示踪物，通过这些稀土离子与具有双功能结构的螯合剂以及抗原形成稀土离子-螯合剂-抗原螯合物。当标记抗原、待测抗原共同竞争抗体，形成免疫复合物，由于免疫复合物中抗原抗体结合部分就含有稀土离子，当采取一些办法将结合部分与游离部分分开后，利用时间分辨荧光分析仪，即可测定复合物中的稀土离子发射的荧光强度，从而确定待测抗原的量。

正常情况下，免疫复合物中的稀土离子自身荧光信号很微弱，若加入一种酸性增强液，稀土离子从免疫复合物中解离出来，和增强液中的β-二酮体、三正辛基氧化膦、Triton X-100等成分形成一种微囊。后者被激发光激发后，则稀土离子可以发出长寿命的极强的荧光信号，使原来微弱的荧光信号增强将近100万倍。

采用时间分辨技术测量荧光，采用了门控技术，它是使背景荧光信号降低到零以后，再测定长寿命标记物的荧光。

三、时间分辨荧光分析的测量方法

（1）解离增强测量法

解离增强测量法是解离增强稀土离子荧光方法，简称DELFIA法。通过双功能基团把Eu3+或Sm3+螯合到抗原、抗体或SA上，免疫反应后，部分标记物结合到固相载体上，未结合的标记物被洗掉。最后用低pH值的增强液，把Eu3+或Sm3+从免疫复合物中解离下来，组成Eu3+-(NTA)3.(TOPO)3或Sm3+-(NTA)3.(TOPO)3新的螯合物，使荧光强度增强将近百万倍。用Arcus型系列仪进行液相检测。本法重复性好，特别适用于大、小分子活性物质的检测。采用DELFIA测量，灵敏度可达10-16—10-18mol的DNA量（即10pgDNA）。此法的不足之处是不能直接测量固相样品的荧光，需要外加增强液，容易受外源性Eu3+或Sm3+干扰，而影响结果，有待改进。

（2 ）固相荧光测量法

固相荧光法又称为DSLFIA法。它是通过具有特殊双功能基团的螯合剂BCPDA，把Eu3+或Sm3+与抗体或抗原螯合。当抗原与抗体发生免疫反应后，固相免疫复合物中Eu3+-BCPDA荧光强度可直接测量。整个过程不用外加增强液，可以直接测量固相样品的荧光，解决了液相测量带来易于污染和操作复杂的问题。现已用于核酸探针检测，取得满意进展，国外已制成药盒供应。

（3）直接荧光测量法

直接荧光法是采用双功能螯合剂二乙三胺五乙酸-对氨基水杨酸（DTPA-PAS）与抗原或抗体偶联，免疫反应后，再加入适量的Tb3+，直接测量液相荧光强度。不需要预先制备Tb3+标记物，简化了操作步骤，但灵敏度较低，仅为10-9mol/l。为提高检测灵敏度，可以引入酶放大系统，以SA-碱性磷酸酶水解5-氟水杨酸磷酸酯，生成5-氟水杨酸，后者在高pH条件下，与Tb3+-EDTA-HCl形成高荧光强度的复合物，可直接测定。

（4）均相荧光测量法

均相荧光测量法是利用特殊的双功能螯合剂W1174，将Eu3+标记小分子活性物质，当与抗体结合后，免疫复合物对Eu3+荧光信号有显著增强或淬灭作用，故在测量前不必进行分离，就可直接测量液相中的荧光强度。该法省去了洗涤、分离和加增强液等烦琐的步骤，具有快速、方便等优点，但不足之处是需要特殊螯合剂。

（5）协同荧光测量法

协同荧光测量法是利用一些不发荧光的稀土离子，如Cd3+、Y3+、La3+、Lu3+等，能使发荧光的稀土离子的荧光信号大大增强。在免疫分析体系中，pH值为6.0-8.0时，它们的荧光强度最大，有利于提高检测的灵敏度。此外，此法可以对一分样品中不同组分含量进行同时测量。但需要特殊的增强液，同时Cd3+、Y3+、La3+、Lu3等稀土离子的纯度对测量结果有明显影响。

四、时间分辨荧光免疫分析的应用

时间分辨荧光免疫分析可用来检测生物活性物质，特别是在生物样品免疫分析中，显示出它愈来愈多的独特优点。在内分泌激素的检测，肿瘤标志物的检测，抗体检测，病毒抗原分析，药物代谢分析以及各种体内或外源性超微量物质的分析中，应用TRFIA法越来越普遍。近年来，已将这项技术应用于核酸探针分析和细胞活性分析、生物大分子分析，发展十分迅速。

（1）TRFIA法在内分泌学中的应用

内分泌激素是一些活性小分子，它们能与适当的抗体反应，具有免疫反应性，但不能产生抗体，不具有免疫原性，它们属于半抗原。对这些半抗原的测定，一般多用竞争性时间分辨荧光免疫法测定。这方面的测定主要有血清中孕酮 [3]、雌二醇 [4]、睾酮 [5]、甲状腺激素 [6]、前列腺素[7]的测定等等。

（2）TRFIA在肿瘤学中的应用

对一些完全抗原，它们大多是既有免疫反应性又有免疫原性的蛋白质类，主要包括促甲状腺激素[8]、血清胰岛素[9]、血清癌胚抗原[10-11]、血清甲胎蛋白[12]、乙型肝炎表面抗原[13]等，主要采用非竞争性TRFIA法进行测定。

（3）TRFIA法在免疫学中的应用

某些免疫细胞（如NK、LAK、T杀伤细胞等）的活性，可以用TRFIA法来检测。如Blomberg[14]等用该方法测定了NK细胞的活性；Granberg[15]等用TRFIA法测定杀伤性T淋巴细胞活性；Volgmann[16]等测定了LAK细胞的活性；Maley[17]用TRFIA法测定细胞介导的、补体介导以及抗体依赖的细胞活性；Lovgren和Blomberg[18]用此法同时测定两种靶细胞的活性；陈泮藻[19]等也用此法测定了T淋巴细胞的活性。这些测定均取得了良好的结果。

（4）TRFIA法在微生物学中的应用

由于TRFIA技术具有灵敏度高和特异性强的特点，TRFIA法在微生物检测和分析中的应用日益广泛和深入。目前TRFIA已广泛应用于乙型肝炎病毒、脑炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞体病毒（RSV）、副粘病毒、风疹病毒、马铃薯病毒、轮状病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）、出血热病毒和梅毒螺旋体的抗原抗体以及某些细菌和寄生虫抗体的检测[2]。最近,潘利华[20]等用TRFIA法进行了人血清中丙型肝炎病毒抗体(Anti-HCV)的检测，效果明显高于酶联免疫法。

五、展望

时间分辨荧光免疫分析具有灵敏度高、特异性强、所用试剂有良好的稳定性、检测限较宽、尤其是能消除常规荧光测定中的高背景等优点，是非放射免疫分析中很有发展潜力的分析方法。有关研究论文约占免疫分析文献的10%-15%。寻找、设计并合成出较理想的镧系元素螯合物探针；改进标记技术和简化分离技术；采用多重标记法进行放大，进一步提高灵敏度以及提高检测手段的程序化，进一步提高信噪比将成为时间分辨荧光免疫分析的发展方向。

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