合作专家 | 赵金兰硕士
生物化学分子生物 中国计量大学
审核专家 | 聂壹峰博士
纳米生物医学 中国科学院大学
简介
荧光免疫层析（Fluorescent Immunoassay，FIA）是一种基于抗体-抗原特异性识别的分析技术，通过荧光信号来检测和定量移动的目标分子。该技术结合了免疫学、荧光学和生物化学等多个学科，具有高灵敏度、高特异性、快速、简便等优点。
原理
荧光免疫层析技术以固定有检测线（包被抗原，T 线）和质控线（抗抗体，C 线）的条状纤维层析材料为固定相，以测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。
对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原（蛋白、病毒等），通常采用「三明治」型双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的「三明治」型。
检测时，样品溶液在毛细效应下向上层析会出现两种显示结果：如果是阴性，样本与荧光抗体不结合，荧光抗体与特定样品偶联剂结合，配套仪器检测结果为阴性；如果是阳性，则样本与荧光抗体先发生反应，当样本抗原含量达到一定量时，荧光抗体就不再与测试区的特定样品偶联剂结合，配套仪器检测结果为阳性。
荧光免疫层析试纸结构示意图
用途
1. 生物医学领域：检测人体内各种生物分子，如肿瘤标记物、病毒、细菌、药物等，用于临床诊断、治疗监测等方面。
2. 生命科学领域：检测蛋白质、核酸、细胞和细胞分子等，用于基因表达分析、蛋白质相互作用研究、细胞分析等方面。
3. 环境监测领域：检测水、土壤、空气等环境样品中的有害物质，如重金属、农药、化学品等，用于环境污染监测和生态保护等方面。
材料与仪器
试剂：硝酸纤维素膜（NC 膜）、样品垫、聚酯膜、聚氯乙烯底板 PVC 底板、吸水纸、阳抗鼠 IgG、待检测样品、荧光微球、
仪器：免疫荧光检测仪、点膜喷金仪、超声波清洗仪、恒温培养箱
步骤
（1）样品的制备：将待检测的样品（如血清、尿液、细胞提取物等）进行必要的处理和稀释，以满足后续实验的需要。
（2）准备试剂盒：将处理后的荧光微球以一定的喷量涂到结合垫上；处理 NC 膜，在合适位置喷涂 T 线和 C 线，在 30 ℃ 培养箱中过夜烘干；随后按照样品垫、结合垫、NC 膜、吸水垫的顺序依次粘贴到 PVC 板上，用高速斩切机切成 4 mm 宽的试纸条，组装上外壳，真空包装机干燥保存。
（3）加样：将制备好的样品加入试剂盒中，与荧光标记的抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
（4）清洗：通过洗涤步骤，去除非特异性结合的物质，保留特异性结合的复合物。
（5）信号检测：通过荧光检测仪，检测荧光素底物的荧光信号，从而定量目标分子的含量。
（6）数据分析：根据样品的荧光信号强度，结合标准曲线或其他计算方法，计算出目标分子的含量。
注意事项
（1）器械消毒：实验所需器械用酒精棉片擦拭干净，最好高温灭菌处理，避免交叉污染，影响实验结果。
（2）注意自身防护：在收集、处置、储存、混匀样本和检测过程中应采取适当的保护措施。
（3）试剂盒要完整：试剂盒（测试卡）在使用前请不要开封，不要使用有明显损坏的试剂盒、包装有破损的测试卡，此外试剂盒（测试卡）为一次性使用体外诊断试剂，请勿重复使用。
（4）试剂和 ID 卡使用要匹配：不同批号的试剂不能混用，ID 卡与试剂盒（测试卡）不得混批号使用。
（5）使用配套仪器：试剂盒（测试卡）及其组件仅适用于配套的快速分析仪。
（6）注意避免损坏仪器或污染：切勿把表面被其他液体沾湿的试剂盒（测试卡）插入检测仪，否则会污染或损坏仪器；用过的试剂盒（测试卡）请妥善处理，不要随意丢弃。
（7）温度要求：应避免实验环境温度过高，低温保存的试剂盒（测试卡）需要恢复至室温后再打开，以免吸潮。
（8）规范仪器操作：试剂盒（测试卡）和配套分析仪在使用时应避开颤动和电磁环境（在正常使用中仪器本身颤动属正常现象）；检测进行时请勿拔出 ID 卡。
（9）检测时间要求：为保证准确的检测结果，试剂盒（测试卡）的机外反应时间和结果读取时间严格按照试剂盒说明书进行，超过规定时间结果无效。
常见问题
（1）信号弱或无信号：可能是由于样品处理不当、试剂未稳定、抗体质量差、洗涤步骤不彻底、荧光素底物浓度不够等原因导致。
（2）非特异性结合：可能是由于样品中存在交叉反应物、试剂盒中抗体质量不良、试剂过期等原因导致。
（3）标准曲线不符合要求：可能是由于标准品制备不当、荧光素底物浓度不够、光度计读数不准确等原因导致。
（4）实验重复性差：可能是由于实验条件不一致、抗体批次差异、荧光素底物质量不一致等原因导致。
（5）实验结果不稳定：可能是由于实验室温度、湿度、光照等条件不稳定、试剂盒存储不当、荧光素底物稳定性差等原因导致。
来源：丁香实验
