关于流式荧光标记补偿设置和荧光三标的疑问

1、准备用FITC，PE和APC进行三标，检测三标细胞占待检测细胞的百分比。

预实验摸抗体浓度时，用单标管与相应的同型对照管比较，在二维散点图上，发现部分指标除在检测通道上偏移，在无关通道上散点也有偏移，我想这就应该是补偿需要做的事情了吧。根据预实验的结果，发现荧光的部分干扰现象，如PE检测影响APC和FITC，FITC影响APC，而APC不影响PE和FITC等。

问题：

（1）很奇怪的是FITC和APC的发射光谱距离很远，应该没有干扰才对。为什么也发现了APC受到FITC的影响？是哪里出了问题？

（2）三种荧光之间是否两两之间都必须进行补偿？是否APC对PE和FITC不需要补偿？

（3）流式可以根据二维散点图检测双阳细胞所占的百分比，那么流式能否测出三标细胞占待检测细胞的百分比？如果可以，应该如何操作？

（4）检测三标各管如何设置才最节省且结果最可信？

APC和前二者间不做补偿。它们不是由同一根激光激发，走不同的光通道，互相之间没有影响，因此不用。PI＆FITC均由488nm激光激发，走相同的光学通道，两者的发射波长有重叠部分，因此要求补偿。

这样说有误导，APC和FITC/PE间确实“通常”不需要compensate（也不绝对），但不是因为激发波长不同，而是由于发射波长相差较远，overlap很少。同是488nm激发的PE-Cy5.5就和APC有overlap，通常需要compensate。

其实compensation很简单，一个一个地run单色control，一个一个地compensate就好了。

2、还有一个问题

阳性细胞和阴性细胞在散点图上应该有明显的分群，但是为什么我检测的图形只是整体有微弱偏移，而并没有明显的分群？

难道是抗体浓度太低了？我也试着提高抗体浓度，提高了一倍，还是没有明显的改观。请帮忙分析一下原因。

（1）关于这三种荧光之间的干扰问题，大家看附件里面的图就明白了，因为FITC的发射光是一个宽范围，会漏到PE里面，所以PE的检测器里会检测到FITC的光，因此需要调解补偿，去除这部分假阳性。应该APC受FITC影响极小。

（2）实际问题在实际中解决，在做多色荧光时，需要先调节电压（一般用空白细胞，而同时加了三种同型对照的样品我一般用作阴性对照），然后用单染管去调节补偿。在电压和补偿调节好后，不放心可以上一遍单染管，看看调节的是否合适，还有无渗漏情况。合适的话再上正式的样品管。

（3）分析试验结果的话，可以先在散点图或者直方图里圈阳性的细胞，取这群细胞在分析另外两个标志物，然后取双阳的细胞（这群细胞将是三阳的细胞）。

（4）如果分析的标志物表达率低，就会出现没有明显分群的情况。这不是提高抗体浓度可以解决的。