简介
流式细胞多标记分析的荧光补偿是指在进行流式细胞术多色分析时，待测细胞通常携带两种或两种以上的荧光素，如异硫氤荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE）、别藻红蛋白（PECY5）等。这些荧光素被激光激发后发出不同波长的荧光，理论上每一种荧光通过选择恰当的滤光片可被相应的检测器检测到，而不受其他荧光的干扰。但实际上这些荧光染料都具有宽发射谱性质，尽管它们的发射峰各不相同，但发射光谱有很宽的范围。如果同时使用这两种荧光染料，就会出现两种发射光谱互相叠加，相近的两种荧光信号之间产生荧光交叉干扰和窜道问题，使检测结果产生误差和假阳性率。为避免这种荧光窜道引起的测量误差，多色分析时必须进行光谱重叠的校正，即荧光补偿，以使相邻的荧光检测器不会检测到彼此的荧光信号。
原理
流式细胞多标记分析的荧光补偿的基本原理是在进行多色流式分析时，进行光谱重叠的校正，即荧光补偿, 以使相邻的荧光检测器不会检测到彼此的荧光信号，避免荧光窜道引起的测量误差。
材料与仪器
器材：
流式细胞仪 (本实验室为 BD Aria)
试剂：
① CD3、CD4、CD8 等荧光标记的特异性单克隆抗体及同型对照抗体；
② 细胞洗液。含 2% BSA，0.2% NaN3 的 PBS，固定液（1% 多聚甲醛 PBS，pH7.2）。
耗材：
流式专用样品管、离心机、玻璃管。
步骤
以 CD3-FITC，CD4-PE，CD8-PEcy5 三色标记染色为例。
（1）分别制备 CD3-FITC，CD4-PE，CD8-PEcy5 单标记管。
（2）制备同型对照或阴性对照管。
（3）上机，将所有补偿和电压调为「0」，然后用同型对照或阴性对照管调整电压，使阴性群位于左下角。
（4）用单标记阳性管依次调节相邻荧光之间补偿。设置 CD3-FITC 与 CD4-PE，CD4-PE 与 CD8-PEcy5 双参数门。
（5）调节 CD3-FITC 与 CD4-PE 的荧光补偿值，使 CD3-FITC 的阴性细胞群和阳性细胞群在 X 轴上平行，在 Y 轴平均荧光强度相等。
（6）CD4-PE 和 CD8-PEcy5 调节补偿与第（5）步基本相同，仅设门所用荧光通道有区别。
注意事项
（1）荧光补偿，通常在两色以上的多色荧光标记细胞时非常需 要，要求在前期样品制备时，必须制备单标记染色管 (补偿管)。例 如做双标记染色分析，必须制备 2 支相匹配单标记染色管，如果是三色标记染色分析，则必须制备 3 支相应的单标记染色管，以备 上机时调节补偿之用。
（2）单标记补偿管，必须是阳性管，否则无法调节荧光补偿。
（3）当细胞群阴、阳性群体有明显荧光峰谷界限时，对有经验 的操作者可不做补偿管。但如果您感兴趣的细胞群与阴性细胞群 的区分不十分明显时，则必须调节补偿，这时补偿管的制备质量和 补偿的技术水平都非常重要。
（4）多色分析时，尽量选择荧光波长差异较大的抗体进行组合。
来源：丁香实验
