简介
间接免疫荧光染色法是先用已知未标记的一抗与待检测的抗原反应。反应一定时间后，洗去未结合的抗体，再与荧光素标记的二抗反应。根据所测定的荧光强度和阳性百分率可以得到相应抗原的密度和分布的比例。
原理
间接免疫荧光染色法的基本原理是：细胞表面有完整的抗原或受体，先用已知未标记的一抗与待检测的抗原反应。反应一定时间后，洗去未结合的抗体，再与荧光素标记的二抗反应。根据所测定的荧光强度和阳性百分率可以得到相应抗原的密度和分布的比例。
材料与仪器
器材：
① 流式专用样品管、离心机、玻璃管。
② 流式细胞仪 (本实验室为 BD Aria)。
试剂：
① 一抗以及荧光素标记的二抗、同型对照抗体，如果没有同型对照抗体，可以用荧光素标记的二抗代替同型对照抗体；
② 细胞洗液。含 2% BSA，0. 2% NaN3 的 PBS，固定液 (1% 多聚甲醛 PBS，pH7.2)。
步骤
间接免疫荧光染色法的基本过程可分为如下几步：
(1) 取 3 只流式专用样品管分别标记为空白管、同型对照管、样品管。将 100 μl 细胞悬液加入流式管中 (细胞悬液浓度为 1 × 104 μl-1)。
注意：细胞活性要好，否则非特异染色较高。
(2) 在空白管中加入荧光素标记的二抗，在同型对照管中加一抗的同型对照抗体，在样品管中加入一抗，混匀 (试剂的用量根据试剂说明书)。
注意：阴性对照抗体应与实验组第一抗体类或亚类相同。
(3)4 ℃ 避光孵育 30 min，加入细胞洗液 2 ml，1000 r/min 离心 5 min，反复洗涤 2 次，弃上清。在空白管中加入固定液 0.5 ml，在同型对照管中加入固定液 0.5 ml，检测时空白管和同型对照管当做对照。
(4) 在样品管中加入荧光素标记的二抗作为样品管，混匀 (试剂的用量根据试剂说明书)。
(5)4℃ 避光孵育 30 min，加入细胞洗液 2 ml，1000r/min 离心 5 min，反复洗涤 2 次。
注意：洗涤要充分，避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合而出现假阳性。
(6) 弃上清，加入固定液 0.5 ml，混匀。
(7) 上流式细胞仪器检测与分析。
注意事项
操作步骤复杂，洗涤中容易损失细胞数。
来源：丁香实验
