简介
混合荧光染色法是指在实验中，遇到两种或两种以上的抗原，同时运用直接标记的荧光抗体和间接标记的荧光抗体染色的方法。
原理
直接荧光标记与间接荧光标记混合染色法的基本原理是在实验中，会遇到检测两种或两种以上的抗原，其中一种抗体是直接标记的荧光抗体，另一种是间接标记的荧光抗体。这时候就要使用混合荧光染色法。
材料与仪器
器材：
流式专用样品管、离心机、玻璃管。
试剂：
① 荧光标记的特异性单克隆抗体、无标记的一抗和同型对照 抗体、荧光标记的二抗、用于封闭的羊或鼠的 IgG；
② 细胞洗液（含 2% BSA，0.2% NaN3 的 PBS），固定液（1% 多 聚甲醛 PBS 液，pH7.2）；
③ 流式细胞仪（本实验室为 BD Aria）。
步骤
直接荧光标记与间接荧光标记混合染色法的基本过程可分为如下几步：
（1) 用羊或鼠的 IgG（终浓度为 0.2 mg/ml) 封闭待检测细胞表面的 Fc 受体。无避光孵育 30 min，加入洗液 2 ml，1000 r/min 离心 10 min，反复洗涤 2 次。弃上清（调整细胞浓度为 2 x 104 μl-1)。
（2) 取 3 支流式管分别标记为空白管、同型对照管、样品管。将 100 μl 细胞悬液加入流式管中（细胞悬液浓度为 2 x 104 μl-1)在空白管中加入荧光素标记的二抗，在同型对照管中加入同型对照抗体，在样品管中加入无标记一抗（试剂的用量根据试剂说明书)。
（3)4 ℃ 避光孵育 30 min，加入细胞洗液 2 ml，1000 r/min 离心 5 min，反复洗涤 2 次。在空白管中加入固定液 0.5 ml，在同型对照管中加入固定液 0.5 ml，检测时空白管和同型对照管当作对照。样品管中加入 100 μl 洗液重悬细胞。
（4) 在样品管中加入荧光二抗，4 ℃ 避光孵育 30 min，加入细胞洗液 2 ml，1000 r/min 离心 5 min，反复洗涤 2 次。100 心洗液重悬细胞（试剂的用量根据试剂说明书)。
（5) 在样品管中加入直接标记的荧光抗体，4 ℃ 避光孵育 30 min，加入细胞洗液 2 ml，1000 r/min 离心 5 min，反复洗涤 2 次。500 μl 固定液重悬细胞（试剂的用量根据试剂说明书)。
（6）上流式细胞仪检测。
注意事项
(1) 混合荧光染色法原则上先进行间接标记染色，然后再进行 直接标记染色。若间接标记为胞内染色时，由于胞内染色需要先固定或打孔，会对细胞膜表面的抗原有损伤。一般是先进行直接标记染色，后进行间接标记染色。
(2) 操作过程中，因离心洗涤次数很多，故应注意细胞数量不 要丢失太多。
来源：丁香实验
