免疫荧光组织（细胞）化学技术系列三：如何设置对照

为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次试验时设置对照：

1、直接法

（1）标本自发荧光对照

标本只加PBS或缓冲甘油封片，荧光显微镜观察组织内如果有荧光，称为自发荧光。

（2）抑制试验

可分为一步方法和二步方法。

一步抑制方法：先将荧光抗体与过量未标记特异性抗体作等量混合，再加在标本上染色，结果应为阴性。

二步抑制方法：标本先加未标记的特异性抗体，水洗后再加标记荧光抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。

（3）阳性对照

用已知阳性标本做直接法免疫荧光组织化学染色，结果应呈阳性荧光。如对照1和2无荧光或弱荧光，3待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。

2、间接法

（1）自发荧光对照：同直接法。

（2）荧光抗体对照：标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。

（3）抑制试验：同直接法。

（4）阳性对照：同直接法。

结果：如对照（1）、（2）、（3）均呈阴性，阳性对照和待检标本呈阳性荧光则为特异性荧光。

3、补体法

（1）自发荧光对照

（2）荧光抗体对照

（3）抑制试验

（4）补体对照：取新鲜豚鼠血清1:10稀释，先作用于标本，洗后再用抗补体荧光抗体染色，结果阴性。

（5）抑制试验：标本加灭活的第一抗体，再加1:10稀释的新鲜豚鼠血清孵育后，再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀释液，结果应为阴性。

（6）阳性对照。

（1）~（5）结果阴性，（6）待检标本阳性时，则为特异性荧光。