免疫荧光组织（细胞）化学技术系列四：荧光素及其标记抗体的方法
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制备荧光抗体是免疫荧光组织化学的重要技术之一，制备特异性强和高效价的荧光抗体必须选用高质量的荧光素和高效价的抗体。
一、荧光素
荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光，停止能量供给，发光也瞬时停止。可以产生明亮荧光的染料物质，称荧光素。目前主要常用于标记抗体的荧光素如下：
1、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）
FITC是一种呈黄色粉末状，性质稳定，在室温下能保存2年以上，在低温中可保存多年，易溶于水和酒精。最大吸收光谱为490~495nm，最大发射光谱为520~530nm，呈现黄绿色荧光，分子量为389.4。在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键结合，成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。一个IgG分子上最多能标记15~20个FITC分子。
2、四甲基异硫氰酸罗达明（tetramethylrhodamine isothiocyanate，TMRITC）
TMRITC是一种紫红色粉末，较稳定。其最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光，与FITC的黄绿色荧光对比清晰，与蛋白质结合方式同FITC。它可用于双标记示踪研究。
3、得克萨斯红（texas red)
得克萨斯红是一种褐色粉末状，易溶于有机溶剂，性质稳定，在4℃下能保存2年以上，最大吸收光谱为590-595nm，最大发射光谱为620-630mm，共有四种结构，常用的分子量为625.15。
4． 其它荧光素
如4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）、7-氨基甲基香豆素（AMC）呈蓝色荧光，藻红素R（phycoerythrin-R），花青（Cyanine、Cy2、Cy3、Cy5和Cy7）等。
二、荧光素标记抗体的方法
1、FITC标记抗体的方法
（1）Marsshall氏法
材料：抗体溶液、0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶(25-50ml) 、冰及冰槽（或1000ml烧杯）、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻棒、棉线及烧杯（500ml）、pH7.2的0.01mol/L PBS葡聚糖凝胶G-25层析柱等。
方法及步骤：
①抗体的准备：取适量已知抗体浓度之溶液，加入三角烧瓶中，再加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后抗体浓度为20mg/ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置于冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不起泡沫为宜）5~10min。
②荧光素的准备：根据标记的抗体总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
③结合：边搅拌边将称取的荧光素渐渐加入抗体溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上（大约在5~10min内加完），加完后，在4℃左右继续搅拌12~18h，通常将装置安放4℃冰箱或冰库中进行。
④透析：结合完毕后，将标记的抗体溶液离心（2000r/min）10min，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中再置于烧杯中用0.01M pH7.2缓冲盐水透析（0~4 ℃）过夜。
⑤过柱：取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。
（2）Chadwick氏法
试剂和材料：抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%重碳酸钠水溶液、0.01 mol/L pH8.0磷酸盐缓冲盐水、1%硫柳汞、离心机及离心管、三角烧瓶(25 ml)、冰槽、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500 ml)透析袋、棉线、玻棒等。
方法及步骤：
①抗体准备：用0~4 ℃的pH 8.0磷酸盐缓冲盐水将抗体蛋白溶液稀释至浓度为30~40 mg/ml，置入三角烧瓶内，放于冰槽中。
②荧光素准备：按每毫克蛋白加入荧光素0.01 mg计算，称取所需之荧光素量，用3%重碳酸钠水溶液溶解。
③将准备的抗体与荧光素溶液等量混合，充分搅匀，在0~4 ℃冰箱中结合18~24 h。
④透析和柱层析：方法同Marshall氏法。
（3）改良法
试剂：
①0.01 mol/L pH7.2 PBS配法：NaCl 18 g、Na2HPO4 1.15 g、KH2PO4 0.2 g，溶于2000 ml蒸馏水中，校定pH至7.2。
②0.5 mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液配法：取0.5 mol/L Na2CO3（5.3%）10 ml加入0.5 mol/L NaHCO3（4.2%）90 ml，混匀后，校定pH至9.0。
③3%重碳酸钠水溶液配法：称1.5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。
方法及步骤：取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水（0.15 mol/L NaCI）及缓冲液（0.5 mol/L NaHCO3-Na2CO3 pH 9.0）稀释使每ml内含抗体10 mg，缓冲液为总量的10%，降温至4 ℃，加入异硫氰酸荧光素，(蛋白：荧光素=80 mg:1 mg)，在0~4 ℃下电磁搅拌12~14 h。然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵(用Nessler氏试剂测验至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。将制备好的荧光抗体加叠氮钠0.01%，分装在1 ml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中（4 ℃）可以用半年以上，-20 ℃保存可达2年以上。
2、四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法
（1）取IgG10 ml（6 mg/ml）在0.1 mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液中透析过夜。
（2）将四甲基异硫氰酸罗达明（每毫克IgG加入5~20 g）溶于二甲亚砜（1 mg/ml），取此溶液300 ml,一滴一滴加入抗体溶液中，同时电磁搅拌。
（3）在室温中搅拌2 h，避光。
（4）把结合物移入直径3 cm，高30 cm大小的Bio-Gel P-6层析柱，用0.01 mol/L pH 8.0的PBS平衡过柱，流速为1.5 ml/min。
（5）收集先流出的红色结合物，即为标记抗体，分装，4 ℃保存备用。
3．藻红蛋白标记抗体方法
（1）巯基化藻红蛋白（phycoerthrin，PE）的制备600 μl的15.5 mg/ml盐酸巯醇亚胺（iminothiolane hydrochloride）加到1.2 ml的3.6 mg/ml的PE中，和1.2 ml PB（pH 6.8）混合，装入透析袋置入50 mmol/L pH 6.8 PB中透析，4 ℃过夜，再换用pH7.5 PB透析6 h。每个PE分子中可结合8个巯基。
（2）巯基PE-IgG制备 异双功能试剂SPDP[N-Succinimdyl 3-(2-pyridyldithio) propionate] 30 g（1.1mg/ml）的乙醇溶液，加入700 μl的4.2 mg/ml IgG PB溶液（50 mmol/L pH 7.5），在室温中反应2.5 h。再加入巯基化PE400 μl（1.7 mg/ml）加到500 μl反应混合液中，室温反应12 h，加入100 μl的50 mmol/L碘乙酸钠封闭残余巯基，在4 ℃用PB透析过夜。加入0.01%NaN3分装，4 ℃保存半年。
（3）PE-标记蛋白A方法
①取4.08 mg PE 溶于0.1 mol/L pH 7.4 PB（含0.1 mol/L NaCl）1 ml中，溶解后，取出0.5 ml，再加入10 μl SPDP无水甲醇液（2.6 mg/ml），SPDP/蛋白摩尔比为10，22 ℃反应5 min，过Sephadex G-50（1×17 cm），用100 mmol/L pH 7.4 PBS（含0.1 mol/L NaCl）平衡和洗脱。
②0.5 ml蛋白（2 mg/ml）100 mmol/L PBS（含有100 mmol/L NaCl pH 7.4），加入2.6 μl上述SPDP甲醇液，SPDP：蛋白A=9：5 ，22 ℃，40 min，加入25 μl二硫苏糖醇（DTT）pH 7.4缓冲液，22 ℃，25 min，同上过sephadex G-25，收集蛋白A峰。
③取0.77 mg/ml的PE和0.27 mg/ml蛋白A等量混合，22 ℃反应6 h，混合物4 ℃保存备用，以上两种PE标记制品，可最后溶于0.01 mol/L pH 7.4 PB（含有0.1 mol/L EDTA、1 mol/L 碘乙酰胺、1% BAS和0.1% NaN3），0~4 ℃保存。
4．蓝色荧光素标记抗体方法
Kbaffan 等(1986)首先创立了蓝色荧光素标记和染色技术，可进行双标记或多标记。
（1）取7-氨基-甲基香豆素（7-amino-4-methyl coumarin，AMC）260 μg溶于二甲亚砜25 μl中。
（2）将上液加入10 ml IgG-巴比妥缓冲液（0.5 mol/L，pH 8.5，内含50~100 mg IgG）中，室温反应2 h，过Sephadex G-50除去游离荧光素, 最大荧光波长430 nm，最大吸收波长354 nm。
