有关流式荧光补偿

在流式细胞仪分析中用到的“荧光补偿”这个术语是指修正荧光渗漏的过程,如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。荧光补偿过程从原理上来说相对简单，但实际上涉及许多精细、敏感的方面从而使在实践操作相当复杂。

非常不幸，荧光补偿操作可能是在流式操作中的数据采集和分析等步骤中最少被了解和掌握的内容，可能是因为在介绍它时经常要用到线性代数来计算，并且还要求了解它的产生原理。然而，正确的荧光补偿对于许多流式分析来说绝对是至关重要的，特别是对现常见的多抗原荧光表达强度分析。因为荧光补偿常被误解、误用并被许多不正确的观念所包围，许多实验室的荧光补偿设置都不正确。本章的一个部分将剖析有关补偿的一些疑惑问题。

流式细胞仪的荧光补偿隔一段时间之后需要调整到适合的位置。如果荧光补偿没有调节好，会导致细胞分群不明显或者流式检测得到的结果图非常不漂亮，而且会影响到检测结果的不真实。荧光补偿的调节对初学者来说非常不容易掌握，同时，补偿调节是流式细胞术中比较难掌握的操作。尤其是一些不常见的标志检测时，需要经验非常丰富的流式操作者根据多年的经验判断调节补偿，才可以得到比较好的数据和图片。

那么，现在不需要这么麻烦。因为补偿微球让一切变得更简单。BD CompBeads是专用于流式细胞仪多色分析的荧光补偿调整微球。它的实用性是在于克服了以往普通的做三色以上的流式分析时补偿难调、耗费样本（往往用待测样本单标来进行补偿调节）的缺点。它本身不携带任何荧光，借助于与客户自己的特异性荧光抗体孵育结合来调节补偿。它不但能象待测的样本细胞一样在同样的实验条件下固定、破膜等，操作起来很简单，灵敏度高，一致性好，使补偿更轻松更准确，而且最难得的是它最适合于多色分析（如五色、六色、七色等）和复合荧光素（如PE-Cy7、APC-Cy7等），因为这时的补偿往往难度较大。各型号的流式仪器均能使用。Compbeads使用后可以将流式的条件保存，方便下次做同样的荧光染色搭配时参考用。

正确的荧光补偿在将弱阳性群体与阴性群体正确区分中有极其重要的作用；荧光补偿不足会导致弱阳性群体是假阳性颗粒增多，而过度补偿则会丢失弱阳性群体而导致假阴性。

荧光补偿是指修正荧光光学信号在探测器之间相互渗漏并被数字化检测的过程。

自单激光双色分析出现后此过程变得十分重要。每种荧光素分子都具有自身的光谱发射范围。这些发射光谱之间存在相互叠加，在某些情况下此现象十分明显。在一个双探测器系统中，可设计将FITC荧光从PE荧光中分离出来。检测荧光发射光时根据其波长和分布将选择其中一小部分进入探测器，这部分荧光可由不同的滤光片从全部发射光中选择特定波长范围的荧光来获得。

这样，FTIC荧由530nm的滤光片选择后送入探测器中；PE荧光则是由575nm滤光片来选择。但是有部分FITC荧光会出现在PE探测器中，这是因为它的发射光涵盖两个探测器滤片的过滤范围。这部分信号我们称之为荧光渗漏，因为它是由FITC荧光渗漏到PE探测器中的。注意想要设计一组荧光滤片来只收集FITC或PE信号是不可能的；因为当同事使用这两种荧光染料时荧光叠加总是存在的。这样只要FITC荧光存在，就会在530nm区得到一个信号，同时也会在575nm区得另一些信号。如这时有PE荧光存在，它也将在575nm区收集。那我们如何才能计数多少信号是来自PE而又有多少信号是由FITC引起的呢？这个计算过程我们称为“荧光补偿”，如去除FITC在PE发射光谱带上的荧光来修正PE探测器中的信号。

一步法荧光补偿

如果一种荧光染料的发射光可以被两个含有不同波段的滤光片的探测器检测到（如，在发射光谱的不同区域检测），那么就能根据其中一个探测器的信号计算出另一个探测中有多少信号。这是因为这两个信号是成比例变化的。这个恒定特性是指我们能够根据绿色荧光探测器中的曲线面积（绿色荧光信号）来精确推算出橙色荧光探测器的曲线面积（如：橙色荧光信号）。

这两个值的比值可在没有FITC以外荧光的情况下计算得知。用于此目的的样本被称为“荧光补偿调节样本”或是荧光补偿质控物，用于精确测定补偿值。对于典型的流式细胞仪来说，FITC发射光在橙色探测器中的信号大概是绿色探测器的15%。因此，如果我们从橙色探测器中减秒绿色探测器信号的15%，那无论有多少FITC信号存在，经校准后的橙色荧光探测器信号将总为零。这时可在系统中加入PE荧光，橙色荧光探测器经扣除了15%的绿色信号后将显示真正的PE荧光信号，而不用再考虑是否存在FTIC荧光了。这就是“一步法”荧光补偿：在第二探测器中修正来自另一荧光的信号。

二步法（双）荧光补偿

通过检测只染有PE荧光的细胞来获知此比例，一般它的数值是2%左右。这称之为PE荧光补偿校正物。

但如果PE荧光出现在FITC探测器中，而同时我们又使用FITC荧光来修正PE探测器中的荧光信号，那这还能有可能来正确修正荧光渗漏来得真正的荧光信号吗？一个不完整的答案来解释此问题：在现有n色荧光分析实验，n是指在仪器上同时检测不确定的荧光数量；这个系统的荧光补偿功能可以完全解决此问题。 (责任编辑：大汉昆仑王)