酶联免疫斑点法（ELISpot）检测INF-γ

互联网2013-03-01

21543

IFN-γ（干扰素-γ）主要产生于激活的T细胞和NK细胞。TH1型响应的特点是通过辅助T细胞和细胞毒T细胞产生IFN-γ，所以高水平IFN-γ的产生是由于寄主应对细胞内的病原体产生了有效的防御。

酶联免疫斑点法通常用于评估抗原特异的T细胞的功效，即检测IFN-γ的释放。酶联免疫斑点法是一种非常灵敏的免疫检测方法，它可以在单细胞水平检测细胞因子的分泌。酶联免疫斑点法是最灵敏的细胞检测方法之一，它检测的灵敏度可以达到1：100 000个细胞。依赖于化学物质的分析，酶联免疫斑点分析可以比传统的ELISA灵敏20到200倍。

一、材料和试剂

1. ELISpotKits

（1）Mouse IFN-γ ELISpotkit（ALP）（Mabtech 3321-2A）

（2）Human IFN-γ ELISpotkit（ALP）（Mabtech 3420-2A）

注释：以上的ELISpotKits可用性已经经过作者测试，用户也可以用按自己的需要换别的替代。

2. 其它材料

（1）SIGMAFASTTM BCIP/NBT（Sigma B5655）

（2）1×Phosphate Buffered Saline（PBS）

（3）Wash Buffer：1×PBS，0.1%Tween-20（Santa cruz biotechnology，sc-29113）

（4）Phorbol 12-myristate13-acetate（PMA）（Sigma 79346）

（5）钙离子载体Ionomycin（SigmaI 9657）

二、设备

1. AID EliSpot Readerclassic（Autoimmun Diagnostika GmbH）

三、步骤

1. 第一天：准备ELISpot板（无菌环境）

（1）用无菌的PBS，pH7.4，稀释包被抗体（AN18）（16 μl 抗体稀释在8 ml PBS，1：500）。

（2）把ELISpot板从包装里拿出来，每个孔加75 μl 抗体溶液，4-8℃过夜孵育。

2. 第二天：在板上孵育细胞（无菌环境）

（1）倒掉过多的抗体，用无菌的WashBuffer（PBS-T）洗板5次，每个孔250 μl。

（2）每个孔加250 μl 的培养基，培养基中包含与用于悬浮细胞的培养液相同的10%的血清（通常是FBS），置于室温孵育至少2个小时。

（3）倒掉培养基，并加入含有诱导物的细胞悬浮液。

一般要做如下几组：不含诱导物的细胞、混有抗原（蛋白或多肽）的细胞和含PMA（10 ng/ml）和钙离子载体Ionomycin（500 ng/ml）的细胞（阳性对照）。每个孔中的细胞数目决定于你的样品中IFN释放细胞的比例，通常是从2×104到2.5×105。如果靶细胞是多肽脉冲T2（T2pulsedwithpeptide）或瘤细胞，那么T细胞/靶细胞的比例需要满足达到最佳的检测效果。

（4）把板置于37℃湿润的培养箱，CO2的浓度为5%，培养12-48小时。在这期间不要挪动板，并设法避免蒸发。

3. 第三天：在板上孵育细胞（无菌环境）

（1）倒空板上的细胞，每个孔加250 μl 的水，保持在冰上10分钟。

（2）用Wash Buffer洗板5次，每个孔250 μl。

（3）稀释检测抗体（R4-6A2-biotin）至浓度为0.5-1 μg/ml（4 μl 抗体稀释在8 ml PBS，1：2 000）。用加有0.5%FBS的PBS稀释。每个孔加75 μl，37℃下孵育2个小时。

（4）用Wash Buffer洗板5次，每个孔250 μl。

（5）用PBS-0.5%FBS稀释Streptavidin-ALP（1：1 000），每个孔加100 μl，室温孵育1个小时。

（6）用Wash Buffer洗板5次，每个孔250 μl。

（7）在10 ml ddH2O中溶解一片BCIP/NBT即配成底物溶液，每个孔加100 μl。

（8）把板放在黑暗中反应，直到有清楚的斑点显示出来。

（9）用大量的自来水清洗终止颜色反应。如果有必要，把板从盘里取出来漂洗干净底下的膜。

（10）晾干板，用ELISpotreader（AIDEliSpotReaderclassic）或在解剖镜下（不推荐）检测并统计斑点数。

（11）板在避光的条件下室温保存。