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酶联免疫斑点法(ELISpot)检测INF-γ

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IFN-γ(干扰素-γ)主要产生于激活的T细胞和NK细胞。TH1型响应的特点是通过辅助T细胞和细胞毒T细胞产生IFN-γ,所以高水平IFN-γ的产生是由于寄主应对细胞内的病原体产生了有效的防御。

酶联免疫斑点法通常用于评估抗原特异的T细胞的功效,即检测IFN-γ的释放。酶联免疫斑点法是一种非常灵敏的免疫检测方法,它可以在单细胞水平检测细胞因子的分泌。酶联免疫斑点法是最灵敏的细胞检测方法之一,它检测的灵敏度可以达到1:100 000个细胞。依赖于化学物质的分析,酶联免疫斑点分析可以比传统的ELISA灵敏20到200倍。

一、材料和试剂

1. ELISpotKits

(1)Mouse IFN-γ ELISpotkit(ALP)(Mabtech 3321-2A)

(2)Human IFN-γ ELISpotkit(ALP)(Mabtech 3420-2A)

注释:以上的ELISpotKits可用性已经经过作者测试,用户也可以用按自己的需要换别的替代。

2. 其它材料

(1)SIGMAFASTTM BCIP/NBT(Sigma B5655)

(2)1×Phosphate Buffered Saline(PBS)

(3)Wash Buffer:1×PBS,0.1%Tween-20(Santa cruz biotechnology,sc-29113)

(4)Phorbol 12-myristate13-acetate(PMA)(Sigma 79346)

(5)钙离子载体Ionomycin(SigmaI 9657)

二、设备

1. AID EliSpot Readerclassic(Autoimmun Diagnostika GmbH)

三、步骤

1. 第一天:准备ELISpot板(无菌环境)

(1)用无菌的PBS,pH7.4,稀释包被抗体(AN18)(16 μl 抗体稀释在8 ml PBS,1:500)。

(2)把ELISpot板从包装里拿出来,每个孔加75 μl 抗体溶液,4-8℃过夜孵育。

2. 第二天:在板上孵育细胞(无菌环境)

(1)倒掉过多的抗体,用无菌的WashBuffer(PBS-T)洗板5次,每个孔250 μl。

(2)每个孔加250 μl 的培养基,培养基中包含与用于悬浮细胞的培养液相同的10%的血清(通常是FBS),置于室温孵育至少2个小时。

(3)倒掉培养基,并加入含有诱导物的细胞悬浮液。

一般要做如下几组:不含诱导物的细胞、混有抗原(蛋白或多肽)的细胞和含PMA(10 ng/ml)和钙离子载体Ionomycin(500 ng/ml)的细胞(阳性对照)。每个孔中的细胞数目决定于你的样品中IFN释放细胞的比例,通常是从2×104到2.5×105。如果靶细胞是多肽脉冲T2(T2pulsedwithpeptide)或瘤细胞,那么T细胞/靶细胞的比例需要满足达到最佳的检测效果。

(4)把板置于37℃湿润的培养箱,CO2的浓度为5%,培养12-48小时。在这期间不要挪动板,并设法避免蒸发。

3. 第三天:在板上孵育细胞(无菌环境)

(1)倒空板上的细胞,每个孔加250 μl 的水,保持在冰上10分钟。

(2)用Wash Buffer洗板5次,每个孔250 μl。

(3)稀释检测抗体(R4-6A2-biotin)至浓度为0.5-1 μg/ml(4 μl 抗体稀释在8 ml PBS,1:2 000)。用加有0.5%FBS的PBS稀释。每个孔加75 μl,37℃下孵育2个小时。

(4)用Wash Buffer洗板5次,每个孔250 μl。

(5)用PBS-0.5%FBS稀释Streptavidin-ALP(1:1 000),每个孔加100 μl,室温孵育1个小时。

(6)用Wash Buffer洗板5次,每个孔250 μl。

(7)在10 ml ddH2O中溶解一片BCIP/NBT即配成底物溶液,每个孔加100 μl。

(8)把板放在黑暗中反应,直到有清楚的斑点显示出来。

(9)用大量的自来水清洗终止颜色反应。如果有必要,把板从盘里取出来漂洗干净底下的膜。

(10)晾干板,用ELISpotreader(AIDEliSpotReaderclassic)或在解剖镜下(不推荐)检测并统计斑点数。

(11)板在避光的条件下室温保存。

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