Elisopt（酶联免疫斑点法）

1、ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。

2、 ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）

3、由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从 20万-30万 细胞中检出 1个 分泌该蛋白的细胞。

4、捕获抗体为BD、R&D、Mabtach生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。

ELISPOT检测原理：细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现"紫色"的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。

ELISPOT技术应用领域：移植中排斥反应的预测、疫苗发展、Th1/Th2分析、自身免疫病研究、肿瘤研究、过敏性疾病研究、感染性疾病研究、抗原决定簇图谱分析、化合物和药物免疫学反应的筛选等等。

现介绍检测人现介绍检测人IFNγ为例的PVDF Eli-spot法，仅供参考。

试剂盒内容：PVDF96孔板，室温保存；0.1ml捕获抗体，4℃保存；0.1ml生物素标记检测抗体，4℃保存；15ul亲和素碱性磷酸酶标，4℃保存；0.25g牛血清白蛋白，4℃保存；0.25g脱脂乳，4℃保存；11ml底物缓冲液，4℃保存；11ml浓缩PBS（10X），室温保存；11ml浓缩洗涤液（200x），室温保存。

自备材料/试剂： 细胞培养液，CO2孵育箱，70%酒精。

可在已包被抗体的孔中直接刺激细胞（直接法），或在24孔板或烧瓶中先刺激细胞，然后放入已包被的孔中（间接法）。使用哪种方法基于：1）检测细胞的类型；2）希望得到的细胞量。如果只需少量的细胞因子生成细胞，使用直接法；如果细胞因子生成细胞较多，最好使用间接法。其它步骤一致。

刺激方法：建议用PMA和娄诺霉素刺激PBMC，使其产生IFNγ。在培养液中稀释PBMC（如：RPMI 1640加2mM谷氨酸盐和10%加热失活的小牛血清），其中含1ng/ml PMA和500ng/ml娄诺霉素（Sigma, Saint Louis, MO）。加2.104至5.104个细胞到抗体包被的PVDF孔，孵育箱中孵育10-15小时。其它的刺激剂孵育时间可能不同，基于细胞因子生成细胞的量，按不同情况作最佳选择。

1. 用100ul 70%酒精孵育PVDF孔板，室温下孵育10分钟。

2. 倒去酒精，用100ul PBS洗涤3次。

3. 3.将100ul捕获抗体加入10ml PBS中，混合， 每孔加100ul， 盖上板盖，4℃过夜。

4.倒去液体，100ul PBS洗涤一次。

5.每孔加入100ul 2%脱脂乳PBS（见试剂准备），盖上板盖，室温下孵育2小时。

6.在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。

7.用100ul PBS洗涤一次。

8.每孔加入100ul细胞悬浮液（含适当量的细胞和相应浓度的刺激剂）。细胞可预先在体外接受刺激（间接Eli-spot）。盖上标准的96孔板塑料板盖，37℃ CO2孵育箱中孵育一定的时间（15-20小时）。这期间不要晃动或移动孔板。

9.在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。

10.每孔加100ul洗涤缓冲液，4℃孵育10分钟。

11.用100ul洗涤缓冲液洗孔3次。

12.于10ml PBS-1%BSA中稀释100ul检测抗体，此为一板的量。每孔加100ul此液体，盖上板盖，37℃下孵育1小时30分。

13.倒去液体，用100ul洗涤缓冲液洗3次。

14.每板以10ml PBS-1%BSA稀释10ul的亲和素碱性磷酸酶。每孔加入100ul此液体，盖上板盖，37℃孵育1小时

15.倒去液体，用100ul洗涤缓冲液洗3次。在吸水纸上拍打，吸干残留的洗涤液。

16.每孔加入100ul BCIP/NBT。

17.室温下反应5-15分钟。完全显色后，将此液倒于相应的盘中。