酶联免疫斑点法与其他检测方法相比之下的优势

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酶联免疫斑点法（ELISpot）

酶联免疫斑点法ELISPOT 最早可追溯到1963年的溶血空斑技术，到了20年后的1983年，该方法才被证实敏感度高且操作方便。之后才开始在检测上大显身手。那么，酶联免疫斑点法与其他传统技术相比，优势何在呢?

ELISPOT的历史可以追溯到1963年Jerne等人创立的溶血空斑技术(hemo-lytic plaque forming cell assay，HPF)，这项技术可用于检测并计数单个抗体形成细胞。随着单克隆抗体技术的成熟，1983年，Czerkinsky等采用此法检测脾细胞中分泌特异性抗体的细胞数，发现该方法敏感性高简便易行。后来，他们又用这种方法定量分析受到有丝分裂原刺激的外周血中分泌IFN2γ的细胞数。随后，用 ELISPOT法在单细胞水平检测分泌其他细胞因子(如IL-2，IL-4，IL-5，IL-10，TNFα和IL-6) 数量的手段也被建立起来。Nordstrom等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法来提高这种方法的敏感性，Herr用计算机辅助图像分析系统 (computer-assisted video image analysis，CVIA)自动分析TNF2α酶联免疫斑点的大小和数量，计算与负载抗原 肽的靶细胞接触后外周血单核细胞(PBMC)中抗原特异性 CD8+T细胞的数量，不但提高了对背景染色的分辨力也使大规模研究成为可能。Vaquerano等将数码相机和计算机结合起来，开发出类似的斑点计数系统，认为当每孔斑点数大于100时，这种方法更客观、可重复性高且节省时间。

随着ELISPOT 技术的不断发展，它的优势也渐渐显示出来，下面将列举ELISPOT对比其它一些传统技术的优势所在。

ELISPOT 分析使单细胞分泌产物可视化。这些分析异常敏感，因为它是在直接在分泌细胞的周围进行捕捉，而且是在表面被冲淡，或者被临近的细胞上的受体捕获，或降解之前。最低至1：100万细胞精度的活体外频率测量。这种分辨率已经远远超过使用细胞内细胞因子的四聚物染色和ELISA法测量的精度。这种高敏感度是非常关键的，因为抗原 特异性 T 细胞在体外都是典型性的低频率。高产量T细胞分析成为可行。一个经过训练的相关实验室小组可以测试成百的样本中几十种抗原的反应。只需要少量细胞，就可以用于通其他细胞学分析方法进行比较。例如，45毫升的血液就足以用于测试600种不同抗原/肽类物质的反应。可以定义CD4和CD8细胞的免疫因子指标。这是因为只需要少数细胞，分析就可以在高产量模式下进行。ELISPOT分析在筛选肽库，绘制免疫因子方面是一个理想的工具。用于确定抗原特异性T细胞的功能性亲和力。这最大可能受到肽类药物刺激至50%的影响。可以用于研究未经药物处理过的细胞的分泌过程。如果观察到净产量减少，可以确定这种区别是来自分泌细胞的减少，还是每个细胞分泌产量的减少。淋巴细胞在ELISPOT分析后依然存活。这使得分析之后进行增值，用于更进一步的分析、克隆或者低温储藏成为可能低温储藏后的人类淋巴细胞可以用于检测，而不会丢失其功能。治疗前和治疗后的样本可以并排进行测试，结果可以重复。

(1) 与ELISA

ELISA 通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过计算机辅助的分析系统对斑点进行计数， 1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。(某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率)由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。捕获抗体具有高亲和力、高特异性、低内毒素的单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。

与有限稀释法(limiting dilution analysis，LDA)

LDA能够对特异性CTL细胞进行定量，曾在很多年中被认为是CTL 检测的“金标准”，它使人们能够详细了解免疫反应动力学和记忆毒性T淋巴细胞(memorial CTL， mCTL) 亚群的细胞周期。但该方法需要高强度抗原刺激，这会加快效应CTL(eCTL)凋亡，且不能定量测定eCTL细胞数量或测定值偏低。其次，该方法较繁琐，培养时间可长达2～3周，而且很容易造成T细胞数量损失。

(2) 与四聚体法(Tetramer)

最近几年出现了MHC2Ⅰ类分子抗原肽四聚体法。该法的优势在于迅速、直接、灵敏且特异性强，即使当体内mCTL水平低于1%，用MHC2Ⅰ抗原肽四聚体法仍可直接测到准确的值，比LDA 敏感度要高5～10倍。但该技术也存在较多应用上的困难：除了合成及稳定MHCⅠ类分子的技术困难外，最主要缺点是表位的选择。由于每次反应只能分析单一的抗原表位，而MHCⅠ类分子结合的各种表位，能否形成CTL反应，却随着基因背景及时间的变化而变化，因此选择正确的表位就显得尤为重要。优势表位的筛选可以通过Elispot 来进行，但对整个肽库进行扫描，并不是一件很容易的事。当然，生物信息学的运用对表位的筛选有很大的帮助。同时，有研究结果表明，并非所有经过 Tetramer 鉴定的阳性细胞都有确切的功能， Tetramer阳性的细胞数是用ELISPOT分析能分泌INF2γ细胞数的10倍，其中很多是不表现功能的惰性细胞，可能代表了记忆型CTL前体细胞。Tetramer分析只增加了分析的灵敏度，同时测定其功能很重要。

(3) 与Cr51释放法

此法是一种比较经典的方法，虽然在检测CTL识别的抗原多样性方面非常有效，且能精确阐明被CTL识别的最佳表位，但至多为半定量的层面，而且Cr51标记细胞的自发释放率较高，不适于较长时间培养;标记时所需的细胞浓度较高，因而给试验带来诸多不便;此外，Cr51释放法所测定的是一个细胞群体的特性，而不是单个细胞。

(4) 与胞内CK染色法

与ELISPOT法相比较，胞内CK染色法(intra-cellular CK staining，ICS) 主要应用细胞内累积细胞因子的染色和多色参数的FACS法，是检测循环淋巴细胞中抗原特异性T 淋巴细胞的可行方法，而ELISPOT法却可以检测所有分泌CK的eCTL 。

应用

目前，ELISPOT已被用于检测药物、化学制剂及其它CK复合物的特性及功能等方面，因此为体内免疫功能的调节效应提供了检测依据。近几年来， ELISPOT技术在肿瘤疫苗评价试验、免疫监测及免疫学研究中越来越被广泛地使用。

(1)人结核杆菌感染的诊断

近年来的研究发现, ELISPOT技术可检测结核杆菌显和隐性感染。通过检测IFN2γ可计数产生IFN2γ的特异性T细胞,计数有色斑点的数量作为结核杆菌感染的特异性诊断指标。应用ELISPOT试验的特异性高,敏感性为96% ,而结核菌素试验敏感性为69%。ELISPOT诊断结核杆菌感染更为快速和准确,可与BCG(卡介苗)接种引起的结核菌素试验阳性相鉴别。

(2)ELISPOT技术在抗肿瘤疫苗研究中的应用

监测疫苗的疗效ELISPOT技术已用于分析和评价从传染病病人的PBMC(外周血单核细胞)中检测肽特异的T淋巴细胞,以及在癌症病人中诱导肿瘤特异的T细胞疫苗试验。鉴定肿瘤抗原表位ELISPOT平板可以提前大量准备,移液、洗板和读板都可自动化, ELISPOT很可能成为定量分析肿瘤或病毒特异性的T细胞反应的首选。

(3)抗感染免疫中的应用

CTL(杀伤性T淋巴细胞)在抗病毒感染的免疫应答中占有主要地位,而CD4 +辅助性T细胞亚群Th1 /Th2的平衡在抵御病毒感染中起着同样重要的作用。此外,利用ELISPOT方法检测CK如IFN2γ就可以进一步了解到针对H IV特异的CTL应答, 相关免疫信息ELISPOT法还用于评价由H IV21感染引起粘膜的CD4+T细胞免疫应答,以及H IVgp 120 g与霍乱毒素共表达的DNA疫苗的免疫源性。在许多抗细菌免疫研究中,该方法也发挥了重要作用。

(5)器官移植方面的应用

受体对供体特异性HLA抗体的存在不仅介导超急性排斥反应而且还可导致急性排斥反应,限制了异体抗原敏感患者对供体器官的需要,因而增加了等待移植的时间。ELISPOT是一种强有效的检测单个抗体分泌细胞的方法,具有很高的敏感性。因此,刺激记忆B淋巴细胞增殖、分化成浆细胞,并建立一种特异性ELISPOT方法检测HLA抗体产生细胞是最佳手段。

(6)其它

此外, ELISPOT检测方法在移植研究,疫苗开发, Th0 /Th1 /Th2细胞转换分析,自体免疫研究,癌症研究,过敏机制探IL24(白细胞介素24)诱导免疫球蛋白亚型转换,传染疾病研究,抗原决定定位图,及体液免疫力研究等方面都有重要应用。

酶联免疫斑点法为体内免疫功能的调节效应提供了检测依据，因而在肿瘤研究、免疫学上应用广泛。因为，与ELISA相比，酶联免疫斑点法更灵敏，与有限稀释法LDA相比，酶联免疫斑点法操作更简便，与胞内CK染色法，酶联免疫斑点法应用更广泛。