酶联免疫吸附实验
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原理
利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。在遇到相应的酶底物时，酶能高效、专一催化、分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的深、浅、可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的大小。该方法可对待检样品进行定性和定量分析；同时具有微量、特异、高效、经济、简便等优点，因此是一种广泛应用于生物和医学领域的微量测定技术。
目前使用的酶联免疫检测方法很多，其种类按检测目的可分为：
目前使用的酶联免疫检测方法很多，其种类按检测目的可分为：
间接法——用于测定抗体
双抗体夹心法——主要用于测定大分子抗原
竞争抑制法——主要用于测定小分子抗原
本实验以血清 IgE 的检测为例学习双抗体夹心法。
ELISA 的原理图
材料与仪器
待检血清
马抗人IgE抗体 辣根过氧化物酶标记的马抗人IgE 抗体 碳酸钠-碳酸氢钠洗涤液 BSA 溶液 H2SO4
酶标板
马抗人IgE抗体 辣根过氧化物酶标记的马抗人IgE 抗体 碳酸钠-碳酸氢钠洗涤液 BSA 溶液 H2SO4
酶标板
步骤
1. 包被酶标反应板
加 1:500 马抗人IgE 抗体（IgG），0.2 ml/孔。37 ℃ 孵育 2 小时后洗涤3 次，10 分钟/次。
加 1:500 马抗人IgE 抗体（IgG），0.2 ml/孔。37 ℃ 孵育 2 小时后洗涤3 次，10 分钟/次。
2. 封闭
加入 1 %BSA ，0.3 ml/孔，4 ℃过夜。取出，洗涤同上。
加入 1 %BSA ，0.3 ml/孔，4 ℃过夜。取出，洗涤同上。
3. 待检血清
加入不同稀释度的待捡血清，0.1 ml/孔。37 ℃孵育 40 min 后，洗涤同上。
加入不同稀释度的待捡血清，0.1 ml/孔。37 ℃孵育 40 min 后，洗涤同上。
4. 酶标记抗体
加入适当稀释度的酶标抗体，0.1 ml/孔。37 ℃孵育40 min 后， 洗涤同上。
加入适当稀释度的酶标抗体，0.1 ml/孔。37 ℃孵育40 min 后， 洗涤同上。
5. 底物
加入OPD（邻苯二胺）溶液，0.15 ml/孔。室温30 分钟。
加入OPD（邻苯二胺）溶液，0.15 ml/孔。室温30 分钟。
6. 终止液
加入 5N HCI ，0.1 ml/孔。
加入 5N HCI ，0.1 ml/孔。
7. 于 20 min 内，用酶标仪测定各孔OD 值，测定波长495 nm。
注意事项
1. 实验时应分别设阳性对照与阴性对照孔，每一待检样品应平行作两份，以保证实验结果的准确性。
2. 实验时，用羊血清、兔血清或BSA 封闭以防止非特异性反应的发生。
常见问题
一、实验结果
用待测标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均吸收值的比值（P/N）表示，当P/N 大于某一数值时（如2.1）判断为阳性，数值的大小依具体检测要求而定。
来源：丁香实验
