载体做共转染(瞬时转染)时的复制起点\启动子问题
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求助者:sunshine046000
各位大侠,我最近准备做共转染,用于分析目的基因的蛋白功能改变,查阅文献发现可以用含目的基因的载体和含有报道基因(b-gal)的载体做共转染以控制转染率。..请问师兄师姐们,如果我的研究目的在于分析目的基因(野生型和突变型)的表达情况以及后续的活性变化。是否最好用含相同启动子,增强子,复制起点的两个载体(比如pcDNA-3.0-目的基因与pcDNA3.0-b-gal)????但文献上似乎并没有完全注意这些东西。.性质相同或性质不同的两种载体都有。.
求救啊,这个问题郁闷了我将近两个月了,没头绪,大家有经验的帮忙一下。
丁香园网友whomso认为:
如果这个b-gal仅仅是个内参的话,没必要两个基因的载体一样
只要两个都能表达就行
你这个应该跟双报告系统差不多,在这个里面的内参也是控制转染率的,它跟其它基因不是一个启动子,因为要求它不受其它信号的影响,否则也就不能成为内参了。
丁香园网友下划线:
我也想问问,如果是共转染,可不可能出现一个转染效率高,一个转染效率低的情况?比如我的内参和实验的比例是1:5,那么,这两个载体转染到宿主细胞中的比例是不是就是1:5?
丁香园网友whomso:
这个具体的原理我也不太清楚,不过在转染过程中通常认为转染效率是一致的,如果内参和实验的比例是1:5,我觉得可以认为转到宿主细胞中的比例也是1:5,但是这两种质粒的表达可能不是完全一样的,因此蛋白的比例就不一定是多少了
丁香园网友swy19523:
there is Omicslink(TM)IRES bicistronic ORF expression vector can meet you need.
OmicsLink™; Bicistronic (IRES)ORF Expression Clones;Internal ribosome entry site (IRES)has been incorporated into OmicsLink™; expression vector systems,which allows coordinated and efficient co-expression of two genes with the same promoter in a single vector.More than 20,000 Human full length protein coding ORF clones (without 5' and 3' UTRs)are now available in OmicsLink™; bicistronic (IRES)expression vectors
fig1
Figure 1.The Principle of Bicistronic Expression Vector
OmicsLink™; Bicistronic (IRES)Human ORF Expression Clones
fig2
ORF1: ; ;Select from more than 20,000 human full length protein coding ORFs ; ;
ORF2: ; ;eGFP
eCFP
eYFP
Luciferase
Biotin Ligase ; ;UBC9
HA-Sumo
His-AviTag-ubiquitin
Neomycin
Human ORFs
丁香园网友zhaolifei认为:
不知道楼主注意到没有:质粒的不相容性,具有相同复制起始点和分配区的两种质粒不能共存于一个宿主菌中。
具有相同复制起始点的两种质粒,共用同一分配系统,彼此之间存在竞争,经过几代分裂后,最初在随即分配中产生的微小差别,最终可导致一种质粒消失
这是我从书上摘下来的,虽然书上说的是“不能共存于同一宿主菌中”,个人以为在哺鲁动物细胞中也不能共存。不知对不对,大家讨论一下
丁香园网友marinayang:
与楼上探讨:
瞬时转染中应该不存在这个问题,质粒的不相容性是随着复制的进行而进行的随机选择性稀释现象,要经过好几次分配才有可能表现出最后的不相容现象。而且此机制需要原核细胞表达系统的辅助。而在瞬时转染后,哺乳动物细胞继续培养的时间一般都不会超过48个小时,因而这种机制不会起很大作用。
与楼主:
共转只是为了检验你的质粒是否纯净,操作手法是否规范合格。也就是说是一个阳性标志物。令外,共转的两种质粒混合均匀以后,其转进去的比例是不会变的,这是一个概率问题。