载体做共转染（瞬时转染）时的复制起点\启动子问题

求助者：sunshine046000

各位大侠，我最近准备做共转染，用于分析目的基因的蛋白功能改变，查阅文献发现可以用含目的基因的载体和含有报道基因（b-gal）的载体做共转染以控制转染率。..请问师兄师姐们，如果我的研究目的在于分析目的基因（野生型和突变型）的表达情况以及后续的活性变化。是否最好用含相同启动子，增强子，复制起点的两个载体（比如pcDNA-3.0-目的基因与pcDNA3.0-b-gal）????但文献上似乎并没有完全注意这些东西。.性质相同或性质不同的两种载体都有。.

求救啊，这个问题郁闷了我将近两个月了，没头绪，大家有经验的帮忙一下。

丁香园网友whomso认为：

如果这个b-gal仅仅是个内参的话，没必要两个基因的载体一样

只要两个都能表达就行

你这个应该跟双报告系统差不多，在这个里面的内参也是控制转染率的，它跟其它基因不是一个启动子，因为要求它不受其它信号的影响，否则也就不能成为内参了。

丁香园网友下划线：

我也想问问，如果是共转染，可不可能出现一个转染效率高，一个转染效率低的情况?比如我的内参和实验的比例是1：5，那么，这两个载体转染到宿主细胞中的比例是不是就是1：5?

丁香园网友whomso：

这个具体的原理我也不太清楚，不过在转染过程中通常认为转染效率是一致的，如果内参和实验的比例是1：5，我觉得可以认为转到宿主细胞中的比例也是1：5，但是这两种质粒的表达可能不是完全一样的，因此蛋白的比例就不一定是多少了

丁香园网友swy19523：

there is Omicslink（TM）IRES bicistronic ORF expression vector can meet you need.

OmicsLink™； Bicistronic （IRES）ORF Expression Clones；Internal ribosome entry site （IRES）has been incorporated into OmicsLink™； expression vector systems，which allows coordinated and efficient co-expression of two genes with the same promoter in a single vector.More than 20，000 Human full length protein coding ORF clones （without 5' and 3' UTRs）are now available in OmicsLink™； bicistronic （IRES）expression vectors

fig1

Figure 1.The Principle of Bicistronic Expression Vector

OmicsLink™； Bicistronic （IRES）Human ORF Expression Clones

fig2

ORF1： ； ；Select from more than 20，000 human full length protein coding ORFs ； ；

ORF2： ； ；eGFP

eCFP

eYFP

Luciferase

Biotin Ligase ； ；UBC9

HA-Sumo

His-AviTag-ubiquitin

Neomycin

Human ORFs

丁香园网友zhaolifei认为：

不知道楼主注意到没有：质粒的不相容性，具有相同复制起始点和分配区的两种质粒不能共存于一个宿主菌中。

具有相同复制起始点的两种质粒，共用同一分配系统，彼此之间存在竞争，经过几代分裂后，最初在随即分配中产生的微小差别，最终可导致一种质粒消失

这是我从书上摘下来的，虽然书上说的是“不能共存于同一宿主菌中”，个人以为在哺鲁动物细胞中也不能共存。不知对不对，大家讨论一下

丁香园网友marinayang：

与楼上探讨：

瞬时转染中应该不存在这个问题，质粒的不相容性是随着复制的进行而进行的随机选择性稀释现象，要经过好几次分配才有可能表现出最后的不相容现象。而且此机制需要原核细胞表达系统的辅助。而在瞬时转染后，哺乳动物细胞继续培养的时间一般都不会超过48个小时，因而这种机制不会起很大作用。

与楼主：

共转只是为了检验你的质粒是否纯净，操作手法是否规范合格。也就是说是一个阳性标志物。令外，共转的两种质粒混合均匀以后，其转进去的比例是不会变的，这是一个概率问题。