DNA重组实验常见问题分析

TaKaRa的内切酶和NEB的内切酶哪个更好一些？

参考见解： TaKaRa的内切酶、NEB的内切酶两个公司的酶的品质都非常好。NEB公司的酶的活性很高，切出两条小带可能是因为出现星活性，可以试试把酶量减半。NEB的酶很多都是克隆的，所以纯度比较高。

应用磁性微球提取人全血基因组DNA，将提取出的DNA直接用于限制性酶切反应，应用Taq1酶，但发现酶切后产生的是smier片断，即切碎的状态。不知原因是什么？在做这类实验时，一般是将PCR产物进行酶切，这与实验结果有联系吗？是不是直接提取出的DNA必须要做PCR扩增，才能应用酶切？

参考见解：

1. 为建立基因组文库时一般才用限制性内切酶酶切人基因组DNA.目的是为获得含有人全部DNA的随机片段的总和.然后再用载体和宿主细胞构建克隆.

2. 电泳图,酶切后是一片弥散的带,是因为基因组中存在大量Taq1酶的酶切位点,由于操作属于随机酶切,所以得到的DNA也是随机的,而不是大量均一的.那么电泳后的出现这样的结果也很容易解释.

3. 一般在PCR后采用酶切是由于酶切模板数目巨大且均一,在了解了被切DNA上有关限制性内切酶位点的信息后,我们就可以根据自己的目的来选择合适的内切酶进行酶切.

做抑制差减杂交,需要回收细菌基因组酶切(Alu1酶)后的全部片段,要求回收后至少是6微升,浓度要有0.3微克\微升,按照抑制差减杂交说明书,采用酚仿抽提和无水乙醇沉淀法,只要酶切2微克基因组就能满足条件,可已经把酶切量扩大到10多微克了,回收还是达不到浓度(大约只有0.06微克\微升),又不敢切胶回收,怕EB对后续反应造成影响。请教该怎么办？

参考见解：回收酶切产物浓度低的原因可能是：苯酚/氯仿抽提时损失太多。说明书上说苯酚/氯仿/异戊醇和氯仿各抽提两次，这样经过四次抽提DNA损失得非常多，解决办法是将50?l酶切产物加等体积的灭菌去离子水，然后再抽提，损失会减少很多；另外乙醇沉淀时可以延长，低温沉淀会提高得率；还有用80％乙醇洗涤沉淀弃上清时，要轻轻用移液枪吸出，防止将沉淀随上清倒出。注意这几点应该可以回收到理想浓度的DNA了。

做PCR将分别将50和300bp片段扩出后，将两个片段连接到一起为550bp，要将550bp片段连到载体上，但550bp片段中间产生了新的酶切位点跟设计的酶切位点AseI一样，想通过部分酶切方法得到550的片段，如果完全酶切就分成原来的两个片段，求教部分酶切的详细方法？

参考见解：可以选择那个和设计不相同的那一端的酶切位点先做连接，之后再进行平化连接，这样就可以避免所设计中的有重复酶切位点的问题了。部分酶切关键是酶切时间，可以先摸索一下酶切的时间。在一个大一点的体系中（比如50微升体系），37度酶切，然后每隔一段时间取出一部分（比如5微升或10微升），然后一起进行核酸电泳，摸索一下合适的酶切时间。部分酶切的话，时间应该不能太长，可以每间隔5分钟或10分钟左右就取一次。

要将PCR片段连入表达载体中,选的是TaKaRa的BamH I和Hind III,请问这个双酶切是在37度反应还是30度,要酶切多长时间?PCR片段比较难切吗,引物两端都各加了3个保护碱基？

参考见解：一般37度2小时就行，在酶切时，由于你所选用的酶都是效率比较高的，酶切一个小时就已经足够了。不过若不放心，过夜也没问题。buffer需要共用buffer(比如Y buffer)。PCR片段的酶切效率与引物两端所加保护碱基有很大关系。如果保护碱基加的恰当，酶切应该不成问题。PCR产物，由于浓度较低，并不难切，只是在连接转化时难以成功。BamH I一般加CGGGATCCCG的酶切效率高达90%。其它酶的具体情况可以查NEW ENGLAND BioLabs的目录。按new england biolab的介绍，hindIII切割的时间较长，如果，直接切pcr产物再连接有时效率不高，导致转化效率低。如果有条件的话，可以先做at克隆，再酶切。TaKaRa的产品目录的A部分里有关于双酶切所用buffer的详细说明，最好依照执行。

PCR反应后，是否可以直接用来酶切，而不需要从凝胶上回收后再酶切！酶切后直接在4％琼脂糖凝胶上电泳分型，有四种片段91，83，72，48BP，想用凝胶电泳对其六种表现型分型，不知可行否？

参考见解：理论上是可行的但是主要取决于PCR产物与酶切产物的大小差距，差距太小不容易获得很纯的片断，为什么不在酶切后连在载体质粒上呢，再筛选阳性克隆，是否作表达？至于看六种表型建议用PAGE胶电泳做SSCP，用银染分辨率高，可能能解决问题。

PCR产物经过酶切连接到载体上，所用酶切位点是（BamHI,EcoRI）均有8个保护碱基。但是无论怎么切，总是连接不上？什么原因？

参考见解：

1、 PCR产物是否经过纯化了？PCR产物中有较高的离子强度，会影响酶切，如果不经过纯化，则酶切体系中的PCR产物应该适当减少。

2、 vector是T-vector还是其他的,如果是其他的话,那要考虑vector在酶切时,是否是切完全了的,将PCR产物测序,看是否有要的酶切site.

3、 虽说有这么多的保护碱基，假设它们对酶切足够的，但也要遵循其它的条件，如这两个酶在做双酶切时，是否用了它们能通用的缓冲液？也就是说这两种在这种缓冲液中必须要有足够的酶切效率。有两种方法可以上试：（1） 分两次酶切。即先用一种酶切，胶回收后再用另一种酶切。这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到了最大的酶切效率。（2） 克隆到T载体中。不知道加的是什么保护碱基，是不是有足够的保护作用？克隆到T载体中，则不要考虑受这个条件的限制。

4、 按照NEB公司推荐的保护碱基经验，BamH1和EcoRI前加CG就够了，用不着加那么多。当然，加那么多不大会是试验失败的原因。

5、 BamH1和EcoRI都是甘油浓度敏感型的，就是说酶量加的太多了会引起Star活性。不知你的酶切体系如何设定的。

6、 先检查设计引物设计中酶切位点是否正确，然后再重复一次。当然先连到T载体是万无一失，但是克隆周期也延长了。

加了保护碱基，却切不动？

参考见解：

1、 酶切缓冲液。每种酶都有公司提供的最佳缓冲液，它们的差别只是离子浓度与体系的不同，如Na、k、Mg等，还有PH值及缓冲体系（一般Tris-HCl），另外酶加甘油和DTT作为保护剂。在双酶切的时候常会遇到两种酶有各自的缓冲液，要达到高酶切效率，选择是个问题，如果酶切时间和量足够，解决的方法：

1) 使用其中一个酶的缓冲液，但要考虑到另一酶的反应效率，反应效率如何，可以查查酶在不同buffer里的效率参数，具体见公司网站，如NEB提供了很好的buffer参数:

2) 使用它们的通用的缓冲液，使两种酶在同一缓冲液里达到也足够的酶切效率；没有通用的BUFFER怎么办呢？ 分两次酶切。即先用一种酶切，胶回收后再用另一种酶切。一般先低盐后高盐，这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到最大的酶切效率，但缺点是要回收，损失大 ；

3) 克隆到T载体中，值得推荐的方法，克隆到T载体中，不须要考虑受这个条件的限制，酶切位点也可以用T载体上自带的。

2、 酶切温度。酶切温度也很重要，一般的酶切最适温度为37度，有些特殊的酶的反应温度不同，如Sma Ⅰ为30度。双酶切时这种情况下最好分开切，先低温后高温。

3、 酶切时间。酶切时间直接影响到酶切是否完全，一般为1-3h，这个时间已经足够，对于一些活性较好的酶，30min就可以酶切完全，建议在酶切1h后取5ul跑电泳以鉴定酶切效率；PCR产物的酶切时间较长，一般过夜。

4、 酶失活。如果使用酶解冻后放置太久，可能导致酶失活。这种情况较少见，只能换新酶。如果拿了不同公司的酶，buffer也不一样，怎么办？放心，可以用不同公司的酶进行双酶切，一般不会有问题的。可以先查查NEB的酶在不同缓冲液中的活性百分比，选择它们都有适中活性的buffer，每个公司生产的酶反应缓冲液针对特定内切酶是最合适的！

5、 酶切体系。选用多大的酶切体系取决于你的样品浓度，在双酶切的时候为了得到质量高的电泳图，尤其插入的是小片段DNA，酶切后产物量较少，可以增加酶切重组DNA的量和增加上样量，建议酶切前测定一下DNA浓度或跑电泳看看DNA有多浓，做到心中有数。

要将目的片段插进载体，选择的酶切位点是Xho1和EcoR1,但是这两个位点共用一个碱基G，即CTCGAGAATTC。还有一对位点是Xba1和Sal1，中间没有空，即TCTAGAGTCGAG。请问这两种情况能不能切开，或是只能通过单酶切来实现？

参考见解：

1、 还是有可能切开的，双酶切不行就分开切试试。再不行，又实在想用这个载体的话，可以变通一下。设计一个短片段DNA，两头带EcoR I的粘性末端，与EcoR I酶切后的载体连接，获得新的载体，以后再做就不会遇到这个问题了。

2、 可以先接上一个片段，再做两次单酶切。例如：载体用BamH I切开，连上两端都是BamH I末端的一个片段------->用EcoR I酶切，回收后再用BamH I切。

3、 先用BamH I和EcoR I同时双酶切试试。不行的话，就先用BamH I酶切再用EcoR I酶切。

怎么才能鉴定质粒有没有被双酶切？

参考见解：酶切后作个质粒自连实验，在感受态、连接酶等没问题的情况下，如果没有菌落长出，说明双酶切是成功的。当然，如果只长了很少的菌落，也是可以的。如果长了很多的菌落，那说明酶切不完全，这时候就只有一个酶切位点切开了，质粒发生了自连。

目的片段连pET32a ，16度过夜，酶连体系为目的片段5μl,载体3μl,T4连接酶1μl，1undefinedBuffer1μl.转化后涂LB－AMP平板，过夜平板长有菌落，但菌落不大，都很孤立，挑取菌落于LB-AMP液体摇菌过夜，试剂盒提取质粒后电泳一片弥散，无目的条带，这是哪个步骤出问题了？

参考见解：

1、 觉得是连接体系可能有问题，目的基因并没有跟载体连上，之所以长菌是由于AMP抗性的筛选压力不够，长了杂菌。

2、 连接体系可能还需要再考虑，首先是目的片断与载体应该是摩尔数之比为3：1～6：1；其次转化是否也存在问题？即使是空质粒也是有条带的。还有可以在转化质粒时，以空质粒为对照这样来比较。

电泳了纯化后的目的片段和载体都有，但载体没目的片段亮，酶连时是不是需要测核酸浓度后再算体积比？

参考见解：必须计算浓度来估计：

质粒加DNA浓度计算：

质粒    PCR产物

电泳后浓度（OD值）  A(18)  B(14)

相对分子量   C（7300）  D(100)

摩尔浓度   A/C  B/D

体积比  x  y

x.a/c/(y.b/d)=1/3=>x/y=bc/3ad(x+y=12Ul,水为12μl)

x/y=16/1,x+y=12

x=16ul,y=1ul

hPer11μl  1μl

PGBKT7 16μl  16μl

T4 ligase 1μl 混匀

1undefinedt4 ligase  2μl

水  12μl