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基于细胞表面标记的免疫细胞分离方法

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1、补体细胞毒分离法

采用特异性抗细胞表面标记的抗体,结合具有该表面标记的细胞,在补体的作用下,使具有该表面标记的细胞发生溶解,将其从混合细胞群体中去除。

2、免疫磁珠分离法

磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子(如Fe3 O4 )为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒,即磁性微珠。在液相中,受外加磁场的吸引作用,磁性微珠可快速沉降。以磁性微珠为载体,包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。

免疫磁性微珠主要用于细胞的分离和纯化,其基本原理及步骤是:首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上,待它与混合体系中的细胞反应后,利用磁力的作用,使与致敏结合的细胞与其它物质分离,达到纯化、分离的目的。通常有二种分离方式:阳性分离和阴性分离。阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶细胞,阴性分离是利用磁珠去除无关细胞,使靶细胞得以分离。

免疫磁珠分离细胞方法简便,快速,无需特殊的设备,且分离纯度高,产率大,近年来已被广泛应用于人类各种细胞的分离,如T、B淋巴细胞、内皮细胞、造血祖细胞、单核/巨噬细胞及胰岛细胞、多种肿瘤细胞等。

近年来,人们又开发出与生物素结合的单抗-亲和素/链霉亲和素-生物素结合的磁性微珠的实验方法,这种方法旨在利用生物素-亲和素间的高亲和力和生物放大作用来增强磁性微珠与细胞的结合力,从而提高细胞的分离效率。为了对细胞分离效果迅速进行分析,可将荧光素标记(如FITC)标记在亲和素/链霉亲合素表面,使所分离的细胞在流式细胞仪(FCM)上立即得到测定分析,从而省去了免疫荧光染色的时间。

目前,实验室针对此种细胞分离技术的常用仪器是磁性激活细胞分离器(magnetic activated cell sorter,MACS)。此装置有一个强有力的永久性磁铁、几个具有不同分离容量的含磁铁基质的分离柱(B1型可分离5×107 细胞,柱体积2.8ml;B2型可分离1×108 细胞,柱体积4ml;C型可分离2×108 细胞,柱体积8ml)和生物素标记的磁珠组成,磁珠直径为50~150mm。分离柱在使用前以高压灭菌。

3、流式细胞术

流式细胞仪由激光光源系统,气控单细胞层流系统,光检测及信息处理系统和细胞分离纯化系统组成。

其工作原理及特点为经过荧光抗体染色的单细胞悬液和鞘液在氮气压力下同时进行流室,形式鞘液包裹细胞悬液的稳定层流,由喷嘴高速射下(1000~5000个细胞/s),与垂直而来的激光束交汇。在混合细胞中,由于细胞大小、胞内颗粒多少及DNA含量等不同,使激光产生不同的散射,分别由散射光检测器接受;细胞上着染的荧光染料在激发光激发下,发射出荧光,由荧光检测器接受,所有信号自动传入电子计算机分析处理,迅速获得细胞类群及其数量的信息。由高频超声振荡器和极向偏转板等构成的细胞分离纯化系统,在分析鉴别不同的细胞类群的基础上,使带有不同电荷的细胞滴通过电磁场时发生偏离,最后将细胞分别收集于不同容器内。

流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微粒(如细菌)等进行快速定量分析和分选的技术,它将免疫荧光与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新技术融为一体,进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。

将荧光标记的单克隆抗体加入PBMC悬液内,使二者特异性结合,通过流式细胞仪自动检测,既可很快得到T、B细胞及其亚群百分率和绝对值的有关数据,又能以每秒高达5000个细胞(18×106 细胞/h)的速度分离和收集无菌的淋巴细胞,纯度可达90%~99%,细胞活性亦不受影响,可用于淋巴细胞的各种免疫生物学功能测定。

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